通过同种异体骨髓与脾细胞移植在小鼠模型中诱导移植物抗宿主病

以一只预先经过照射以抑制宿主免疫系统的麻醉受体小鼠开始。

从遗传背景不同的供体小鼠中获取造血干细胞，以模拟异基因干细胞移植。

使用磁珠去除供体T细胞。

将这种去除了T细胞的悬液注入受体小鼠的眶后腔。

移植的细胞进入血液，迁移至骨髓血管，并利用黏附分子进入微环境，启动造血过程。

将来自同种异体供体小鼠的脾脏T淋巴细胞注入受体小鼠的眼后眶隙，以诱导免疫交叉反应。

这些异源反应性T细胞迁移至各种组织。

T细胞表面受体与受体细胞的抗原结合，识别其为外来物质。

这会触发T淋巴细胞内一系列的信号传导事件，导致其活化。

活化的T细胞会触发一种炎症级联反应，其特征是募集更多的免疫细胞，这些细胞共同损伤宿主组织，从而导致移植物抗宿主病的发生。

在受体 BALB/c 小鼠接受全身照射后一天，将一只 CD45.1/Ly5.1 B6.SJL 供体小鼠俯卧置于洁净的操作套管上，用 Semken 镊子13厘米长的弯曲且带锯齿的一端提起一侧跟腱处的毛发。

使用刃长8.5厘米的硬质精细直头剪刀，从镊子夹持处至一侧足跟之间剪开皮肤，并将切口向头侧延长，以便剥离后肢的皮肤和毛发。当后肢皮肤完全去除后，分别剪断每个髋关节、踝关节和膝关节。

将每条后肢的股部和小腿置于一个盛有 PBS 并置于冰上的 92 毫米培养皿中，小心地从每根骨头上尽可能多地去除肌肉，并将清理后的每根股骨和胫骨转移至装有无菌 RPMI 1640 培养基的 50 毫升离心管中，离心管置于湿冰上。

为分离骨髓，将一根骨头转移至一个新的92毫米培养皿中，培养皿内装有新鲜的RPMI 1640培养基，用手术刀切除每根骨头的两端。接着，使用配备26号针头的1毫升注射器，每次用1毫升新鲜培养基冲洗骨头，将冲洗液收集至含有5毫升培养基的50毫升收集管中。

当所有骨骼冲洗完毕后，轻轻吹打松散的骨髓组织数次，以制备单细胞悬液。在将细胞通过40微米孔径的细胞滤网过滤至新的50毫升收集管之前，先通过离心沉淀细胞，并将细胞重悬于5毫升氯化铵-钾裂解缓冲液中，在室温下孵育3分钟。孵育结束后，加入10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）终止反应，并再次离心细胞。

将沉淀重悬于2毫升新鲜PBS中用于计数，并保留一份含有6 × 10⁶个细胞的等分试样，用于后续流式细胞术分析。接下来，使用 commercially available 细胞纯化试剂盒，根据生产商说明书，通过磁性分离法去除骨髓单细胞悬液中CD90.2阳性T细胞，并保留一份T细胞耗竭后流出液的等分试样（含1 × 10⁶个细胞），用于分离前后细胞纯度和组成的后续流式细胞术分析。

然后，使用配备30号针头的1毫升注射器，将5 × 10⁵个去除了T细胞的骨髓细胞和100 µL PBS经静脉注射至每只经辐照受体动物的眼后静脉窦。

次日，将从供体动物中获取的脾脏置于50毫升收集管中的40微米细胞筛网上，用注射器活塞将脾组织压过筛网进入管中。用PBS冲洗细胞筛网和活塞以收集全部脾细胞，经红细胞裂解处理后，通过离心形成细胞沉淀。将白细胞重悬后进行计数，并保留6 × 10⁶个细胞用于后续流式细胞术分析。

为了从总脾细胞中分离出全部 CD3 阳性 T 细胞，按照生产商说明书使用 commercially available 细胞纯化试剂盒，并从阳性细胞组分中预留 1 × 10⁶ 个 CD3 阳性 T 细胞等分试样，用于分离前后下游流式细胞术分析细胞纯度与组成。随后，将 7 × 10⁵ 个同种异体反应性 CD3 阳性 T 细胞与 100 微升 PBS 通过眼球后静脉注射至每只受体小鼠体内，以诱导移植物抗宿主病（GvHD）。