0 次观看 • 3:56 分钟 • July 8th, 2025
取一种经过基因改造的人肝癌细胞培养物，使其表达钠-牛磺胆酸共转运多肽（NTCP）——一种跨膜受体。
加入重组乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）。该病毒包含一个含有表面蛋白的外层包膜和一个包裹基因组的内层核衣壳。插入荧光素酶报告基因会抑制病毒的复制能力。
病毒包膜蛋白与宿主细胞的NTCP受体结合。
NTCP 与表皮生长因子受体（EGFR）相互作用并发生寡聚化，从而诱导由 EGFR 介导的病毒内吞作用。
病毒包膜与内体膜融合，释放核衣壳，核衣壳在核孔复合体处解体。
病毒基因组进入细胞核后转化为共价闭合环状DNA（cccDNA）——一种稳定的模板，可编码病毒蛋白，包括荧光素酶。
在预设的时间间隔收集细胞，并裂解以释放胞内荧光素酶。
加入报告分子底物。荧光素酶氧化该底物，产生信号。
感染后荧光素酶活性升高表明病毒基因组持续表达。
将稳定表达易感染HBV的钠-牛磺胆酸共转运多肽（NTCP）的HepG2细胞接种，并在37摄氏度和5% CO2条件下培养。
感染前一天，将约 5 × 104 个 HepG2/NTCP 细胞接种至 96 孔胶原蛋白包被板的各孔中，每孔加入 0.1 毫升培养基。将重组 HPV 在 37 摄氏度水浴中解冻，直至管内仅剩少量冰晶。
通过混合78微升新鲜培养基、2微升DMSO、10微升溶于1×PBS的40% PEG8000以及10微升重组HPV，制备用于感染的培养基。向96孔板的每孔中加入100微升重组HBV溶液。
感染后一天，用 300 微升 PBS 将细胞洗涤三次，以去除病毒组分中的污染报告蛋白。向感染的细胞中加入含有 2% DMSO 的 200 微升培养基，并培养一周或更短时间。
为进行乙型肝炎病毒（HBV）感染的分析，在感染后一周，用 PBS 洗涤感染的细胞三次。向感染的细胞中加入 50 微升裂解缓冲液。轻轻摇动培养板 5 分钟，然后在 2000 × g 条件下离心 5 分钟。向发光仪检测板中加入 50 微升报告分子底物，随后加入 20 微升细胞裂解液，并通过短暂振荡混匀。最后，将检测板放入发光仪中并开始读数。