Name: 配售早期鸡胚生长因子包被的磁珠 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 了解生长因子包被磁珠植入鸡胚神经管的技术方法，用于研究发育生物学中的细胞命运决定机制。该技术可在E2.5期胚胎中精确操控组织发育过程。

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1. 从培养箱中取出卵
在E2-2.5（约HH 17期）时取出鸡蛋，并进行相应处理。可立即进行操作，也可将鸡蛋放回孵育箱中数小时。鸡蛋在室温下安全放置超过一小时是可行的。在操作期间，鸡蛋可一直置于孵育箱外。有时这些操作可能需要一小时或更长时间。
注意：在室温下放置的时间越长，其存活的可能性越低。
2. 墨汁的制备
<ol>
<li>配制新鲜的4%印度墨水无菌PBS溶液。</li>
<li>用该溶液填充一支3 mL注射器。</li>
<li>在注射器上安装一根27号、½英寸长的针头。</li>
<li>使用止血钳将针头弯曲成90°角。</li>
</ol>
3. 打开卵壳并注射印度墨水
<ol>
<li>用一对镊子掀开胶带，打开观察窗，并将胶带反面贴在蛋的背面以固定窗口。</li>
<li>引导斜角针头进入，使其刚好位于胚胎下方。将针头置于漂浮的胚盘下方，可确保墨水（对胚胎有毒性）不会直接接触胚胎。</li>
<li>只需注射足量墨水以产生清晰的对比度即可，通常少于¼ mL。</li>
</ol>
4. 打开神经管
<ol>
<li>取一把精细解剖剪，剪开位于胚胎上方或有时环绕胚胎的薄层膜结构。</li>
<li>使用一对55号镊子或钨针，从后向前打开神经管。确保切口足够大，以便将小珠置入其中。</li>
</ol>
注意：根据年龄的不同，可使用精细的钨针完成相同操作。
5. 获取包被的肝素-丙烯酸珠
<ol>
<li>使用一对55号镊子，在溶液中找到一颗完整的珠子。让珠子自行附着在镊尖上，然后缓慢闭合镊子。</li>
<li>将珠子从溶液中取出，并移至卵的上方。</li>
<li>一旦珠子离开其溶液，除非放入蛋清中，否则不易脱落。</li>
</ol>
6. 放置微珠
<ol>
<li>将微珠放置在目标区域上方后，使用钨探针将其引导至前脑或固定在后脑。</li>
<li>使用10 µL移液器加入少量PBS。</li>
</ol>
7. 封闭卵壳
<ol>
<li>使用一小条胶带将窗口封闭，合上蛋壳。</li>
<li>按照预处理方案密封蛋壳，方案详见&nbsp;<a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306" target="_blank">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306</a>。</li>
</ol>

<ol><li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+Chicken+Eggs+for+Developmental+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Jounal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies.</a> Jounal of Visualized Experiments. 8, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306</a> (2007).</li>
<li>Crossley, P. H., Martinez, S., Ohkubo, Y., Rubenstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+expression+of+Fgf8%2C+Otx2%2C+Bmp4%2C+and+Shh+in+the+rostral+prosencephalon+during+development+of+the+telencephalic+and+optic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Coordinate expression of Fgf8, Otx2, Bmp4, and Shh in the rostral prosencephalon during development of the telencephalic and optic vesicles.</a> Neuroscience. 108, 183-206 (2001).</li>
<li>Alexandre, P., Bachy, I., Marcou, M., Wassef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+regulations+by+FGF8+contribute+to+midbrain+roof+plate+developmental+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%22%5BJournal%5D)">Positive and negative regulations by FGF8 contribute to midbrain roof plate developmental plasticity.</a> Development . 133, 2905-2913 (2006).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

根据您希望使用的蛋白质种类，有不同的方案用于制备微珠。在这些实验中，我们使用肝素-丙烯酸微珠，但也可使用Affi-Gel微珠。我们发现肝素-丙烯酸微珠在卵白蛋白的水性环境中更容易操作。微珠在4°C下用5 µL蛋白溶液浸泡过夜。对照组微珠则置于无菌PBS中，直至植入时使用。使用鸡胚体内实验体系的优势在于胚胎仍存活，并可正常发育1。尽管外植体所处的环境可针对特定变量进行控制，但活体胚胎能够更准确地反映蛋白质对发育模式的影响2-3。所有适用于外植体的检测方法，均可应用于胚胎。

<table><tbody><tr><td>鸡蛋</td><td>动物</td><td></td><td></td><td>已受精，E2-2.5（约 HH St. 17）</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Profi-I</td><td>Lyon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>印度墨水</td><td>工具</td><td>Higgins</td><td></td><td>用无菌 PBS 配制 4% 溶液。</td></tr><tr><td>无菌 PBS</td><td></td><td></td><td></td><td>也可使用抗体混合物</td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>27G 1/2 针头</td><td>工具</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td>成 90 度角</td></tr><tr><td>镊子</td><td>工具</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td>55 号</td></tr><tr><td>止血钳</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖剪刀</td><td>工具</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500086</td><td>vannas 型，8.5 cm</td></tr><tr><td>Parafilm 膜</td><td></td><td></td><td></td><td>用于密封鸡蛋</td></tr><tr><td>钨针</td><td>工具</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62091</td><td>工具 #24，手柄可选。</td></tr></tbody></table>

在早期鸡胚上放置包被生长因子的微珠

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

在发育过程中，神经管以特定的时空模式表达多种蛋白质。这些蛋白质已被证实对细胞命运决定、细胞迁移以及神经环路的形成至关重要。神经元诱导和模式形成涉及骨形态发生蛋白（BMP）、 sonic hedgehog（SHH）、成纤维细胞生长因子（FGF）等多种因子。特别是，Fgf8 的表达模式与表达 BMP4 和 SHH 的区域相邻。这种表达模式与促进端脑模式形成的发育相互作用相一致。

本文提供了一种可视化演示方法，可用于在鸡胚内（in ovo）研究成纤维细胞生长因子（Fgfs）在前脑形成过程中的作用。将蛋白包被的琼脂糖珠植入发育中的神经管内，以实现持续的蛋白暴露。由于该操作使用体积微小且定位精确的琼脂糖珠，因此侵入性极小，并可在单个神经管内放置多个琼脂糖珠。此外，该方法允许胚胎继续发育，从而可在更成熟的发育阶段对胚胎进行分析，以检测解剖结构和神经图式的变化。这一简单而实用的实验方案支持实时成像，提供了一种在空间和时间上对内源性蛋白水平进行有限调控的手段。

多种生长因子和蛋白质相互作用，诱导细胞在发育过程中分化为不同的细胞命运。在此，我们通过在E2.5鸡胚上放置含有蛋白的琼脂糖珠，展示如何利用鸡胚内实验体系来研究不同蛋白质在发育过程中的潜在相互作用。

神经管在发育过程中以特定的时空模式表达多种蛋白质。这些蛋白质已被证实对细胞……至关重要。

欢迎来到Raburn实验室。我是加州大学欧文分校神经生物学与行为学系的Matt Korn。今天我们将取一枚卵，将其打开，并放入一颗经生长因子浸泡过的珠子。通过精巧的卵细胞制备，我们能够引入一种生长因子，从而改变胚胎发育早期阶段多种不同类型组织的命运。第二天半，即第17期。好的，我们现在位于显微镜前。我已经准备好了鸡蛋和所有工具。现在，请取出一个鸡蛋，你会看到胶带的位置，即窗封处。我有一个漂亮的迷你甜甜圈，它是由艺术商店可以买到的艺术黏土制成的。我将使用一把非常不趁手的五齿镊子。这些工具已经存在很长时间了。吸头的尖端比较钝，但非常适合将胶带轻轻抬起到刚好弹出窗口的程度。我可以把这些放下去了。我只需将其这样折叠起来，把卵和后面的这个窗口一起收好。这样我就可以将其放到显微镜下，进行各种操作。本实验中，我们将使用微珠，我现在就去取印度墨水，不过暂时先不用印度墨水。你可以看到这里有一个小小的胚盘，稍微偏向一侧。如果我把鸡蛋转动一下，就能看到一些血液在这里形成了一个环状。接着，我可以继续用针吸取碳素墨水。我将稍微从侧面移开，然后从培养皿下方观察，里面有一个胚胎。我不需要放得太多，只要能看清胚胎与黑色背景之间的对比即可。然后，我将直接旋转一下，使胚胎的头部朝向前方。在这里可以看到头部区域。神经管延伸至此，我们还能观察到一些体节，可用于判断其发育阶段。如果我继续放大，就可以看到心脏跳动虽然非常缓慢，但节律稳定，这是很好的现象。心脏就在那里，但没有跳动。我们多少会担心这是否是一个有活力的样本。由于心脏表面没有真正的厚膜覆盖，我可以直接使用这里的钨探针。我，这里有一层薄膜，我只需稍微移开一下以便接触到胚胎。我们将珠子植入前脑以及后脑。而这一次，我将针对前脑进行操作。现在，为了到达目标位置，我需要切开一层膜。当样本较年轻时，我可以直接使用钨针，通过神经管进入，从而接触到我需要放置珠子的区域。接下来，我将使用我的钨针。我用双手来稳定我的手部动作。现在我将推进操作，移动胚胎。一旦我把珠子放到这里，就可以直接将其置入神经管，并到达前脑区域。现在我已经将胚胎打开，可以继续进行准备并放置琼脂糖珠。接下来，我将探针再深入一点，以打开神经管，如您所见，我已经完成了这一步骤。我将再稍微放大一些视野。我只是稍微调整了一下焦点。你可以看到那里有一个不错的微小开口，但我并没有在尾部头甲的上方打孔，因为珠子要放置的位置就在这里。所以我不希望在珠子可能浮出的位置打孔。我需要稍微向后留出一点空间，这样我才能放入珠子并向前推动。现在我将取一颗珠子。你可以看到，珠子有许多不同的尺寸。这些是丙烯酸肝素材料，置于 PBS 中。我将使用一把 55 号镊子。可以看到，我会将镊子伸入 PBS 中，挑选一个合适的目标。一旦它离开 PBS，通常会粘在镊子上，你可以看到它在那里。继续将珠子盖好，把我的卵移回。我要将卵细胞调至对焦清晰。现在我将使用55号镊子夹取珠子。镊子的位置比我平时习惯的稍高一些，但目前这样也可以。我将引导它进入我在神经管上制造的孔洞处。一旦将其插入神经管，就很容易将其向发育中的大脑前端移动。因此，我将使用我的钨探针，直接推进。在将珠子放置于头节时，必须小心操作，因为随着胚胎发育时间的延长，胚胎会逐渐向前弯曲，然后向侧面弯曲。很多时候会出现这样的情况：当你在前脑区域放置珠子以作用于头节时，珠子会向喙部方向滑落，这是因为喙部形成于胚胎的腹侧区域，而脑部则位于背侧区域。但这个样本看起来位置相当理想。我对这个结果比较满意。接下来，我将使用移液枪吸取10微升无菌PBS，并滴加几滴到这里。好的，现在我们可以继续操作，将鸡蛋封闭。我要做的是将窗口部分掀起来，向上并翻转过去，此时蛋还没有封好。为了防止蛋干燥，我接下来会取一段我们一直在使用的塑料胶带，剪下一小段，大小比窗口稍大一些即可。我会稍微拉伸一下，然后将其正好覆盖在这个窗口上，确保其平整且紧密贴合。这样，我们在排出蛋清或切割窗口时所形成的所有孔洞都被密封住了。现在鸡蛋已经完全密封，不会流失任何蛋白，也不会变干。它应能正常发育。以上就是关于珠子放置的全部内容。祝您的鸡胚实验顺利，希望您获得理想的结果。

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科研

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生物学

配售早期鸡胚生长因子包被的磁珠

本视频展示了两种制备和放置生长因子包被微珠的方法，这些微珠可应用于发育中大脑皮层的组织块上。这些微珠可用于在发育中的神经组织（如前脑组织块）上诱导空间受限的基因表达。文中提供了使用Affi-Gel微珠和肝素丙烯酰胺微珠的两种方法。...

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追踪早期鸡胚中的形态发生组织形变

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一种用于早期鸡胚长期 Ex Ovo 活体延时成像的浸没式滤纸夹心培养法

该方法中，胚胎心脏组织经过显微手术分离、解离、荧光标记后，植入宿主胚胎组织。这为研究异位血流动力学条件下和/或改变的旁分泌/邻近分泌环境下的细胞或组织水平发育调控提供了平台。...

基于显微注射的禽类胚胎体内植入胚胎心肌细胞系统

浸泡珠实验涉及在发育的任意时间点将测试试剂靶向递送，以研究细胞分化和形态发生的调控。本文提供了一种详细的实验方案，适用于任何实验动物模型，介绍如何制备三种不同类型的浸泡珠，并将其植入鸡胚的趾间区域。...

利用浸润珠实验分析鸡胚胎发生过程中的细胞分化、形态发生与图式形成

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