实时成像巨噬细胞对IgG调理红细胞的吞噬作用

取一个含有小鼠巨噬细胞的通道载玻片。该通道与充满培养基的储液池相连，为巨噬细胞提供营养物质。

更换为含有荧光标记抗体的培养基，这些抗体可结合特定的表面糖蛋白，从而标记巨噬细胞。

取用荧光标记细胞膜的人类红细胞（RBC）。用小鼠IgG抗体对红细胞进行调理，该抗体可特异性结合血型糖蛋白A。

将IgG包被的红细胞加入含有巨噬细胞的载玻片中。巨噬细胞的Fc受体结合红细胞表面IgG的Fc区域，导致Fc受体在接触区域周围聚集，从而标记红细胞以进行吞噬作用。

结合会触发细胞内信号通路并激活GTP酶。活化的GTP酶驱动肌动蛋白的重排和聚合，形成称为丝状伪足的细膜突起。

此外，伪足延伸并包裹红细胞，将其包绕于正在形成的吞噬杯内。吞噬杯边缘融合，形成吞噬体，将已调理的红细胞内化以进行降解。

使用共聚焦显微镜，获取单个吞噬事件的时间推移图像。

为了标记腹腔巨噬细胞，将每个通道载玻片中的碳酸氢盐培养基替换为添加了HEPES的完全培养基，并倾斜载玻片，使100微升含荧光标记的小鼠巨噬细胞特异性抗体的溶液逐滴加入至载玻片100微升通道的入口处。吸除流入下游储液池的培养基，并将细胞在37摄氏度、无二氧化碳的湿盒中孵育20分钟。

在对腹膜细胞进行标记的同时，轻轻混匀4至2,000个红细胞样本，并将400微升细胞转移至层流罩内预热铝块中的一个新2毫升微量离心管中，孵育约5至8分钟。

当细胞升温至37摄氏度时，将0.4微升适当的红色荧光质膜染料与细胞混合，并将细胞放回加热块中。5分钟后，加入1.6毫升新鲜的含HEPES的完全培养基洗涤细胞，然后离心。旋转离心管以识别红细胞沉淀。

使用 1 至 1.5 毫升的移液枪头，小心分两次吸出上清液，切勿扰动沉淀。然后，将 2,000 微升新鲜的含 HEPES 的完全培养基与细胞混匀。离心后，将沉淀重悬于 400 微升培养基中。随后，将试管标记为 PMS，即质膜染色（Plasma Membrane Stain）。在腹膜细胞标记孵育 20 分钟结束后，用 1 毫升新鲜的含 HEPES 完全培养基洗涤载玻片。

为了调理红细胞，向PMS样本管中加入1微升小鼠IgG2b单克隆抗人CD235a抗体。在37摄氏度下孵育8分钟，每分钟混匀一次，然后将100微升经血浆膜染色并由IgG调理的人红细胞转移至含有腹腔巨噬细胞的通道载玻片中。一旦加入人红细胞，立即将载玻片置于旋转盘共聚焦显微镜上，载物台孵育箱设定为37摄氏度，并立即开始对细胞进行成像。