0 次观看 • 2:53 分钟 • July 8th, 2025
首先，取一支含有在无血清培养基中的癌细胞的离心管，以尽量减少检测过程中血清酯酶的干扰。加入非荧光性的钙黄绿素AM染料进行孵育。
活细胞内的酯酶将钙黄绿素AM水解为不可透过细胞膜的荧光钙黄绿素染料，后者保留在细胞质中。
将经钙黄绿素染色的癌细胞和效应NK细胞加入检测孔中，而对照孔仅含有钙黄绿素染色的癌细胞，不加入NK细胞。
NK细胞的活化细胞表面受体与癌细胞上的活化配体结合，形成免疫突触。这种结合激活了NK细胞的信号通路，使含有穿孔素和颗粒酶的细胞毒性颗粒极化并朝向突触释放。
穿孔素在癌细胞膜上形成孔道，促进颗粒酶进入细胞并启动凋亡。细胞膜完整性受损导致荧光钙黄绿素泄漏，从而降低癌细胞的荧光强度。
拍摄各孔的荧光图像。
NK细胞共培养孔中荧光标记的活癌细胞数量少于对照孔，表明NK细胞对癌细胞具有细胞毒作用。
为了使用钙黄 AM 评估自然杀伤细胞介导的细胞毒性，在人肝癌细胞系细胞生长至 70% 至 80% 汇合度后，如图所示，将细胞重悬于 3 毫升无血清 DMEM 中，并加入 1.5 微升 10 毫摩尔/升钙黄 AM 溶液，在室温下标记 30 分钟。孵育结束后，通过离心收集细胞，并用 5 毫升 PBS 洗涤两次，每次洗涤使用 5 毫升 PBS。
将细胞重悬于培养基中，浓度为每毫升1 × 105 个细胞，每种处理条件下，每孔加入100微升细胞悬液至96孔板中，每个条件设三个复孔。随后，向每孔靶细胞中加入含1 × 105 个人源NK细胞的100微升培养基，将培养板置于细胞培养箱中孵育4小时。
孵育结束后，在荧光显微镜下以10倍放大倍数，针对每种处理条件的每个重复样本，至少拍摄10个不同视野的钙黄绿素AM阳性细胞图像。然后，使用公式计算细胞毒性百分比。