腹腔巨噬细胞对凋亡胸腺细胞吞噬作用的分析

胞葬作用是指吞噬细胞清除凋亡细胞的过程。

为了分析胞葬作用，获取易发生凋亡的小鼠胸腺细胞，并用可穿透细胞的CFSE染料进行孵育。

胞内酯酶将CFSE裂解为细胞不可渗透的荧光染料，从而对胸腺细胞进行染色。加入热灭活血清以防止过度染色。

将染色的胸腺细胞接种到培养板上。加入蛋白激酶抑制剂星形孢菌素（staurosporine），该抑制剂可破坏关键的细胞信号级联反应，从而诱导细胞凋亡。此外，磷脂酰丝氨酸残基会转位至细胞膜的外层小叶，发挥“吃我”信号的功能。

将逐渐增加的凋亡胸腺细胞浓度加入含活化小鼠腹腔巨噬细胞的多孔板孔中，这些巨噬细胞表达特定的受体酪氨酸激酶。

这些激酶可结合凋亡胸腺细胞暴露的磷脂酰丝氨酸，促进巨噬细胞对其内吞。

孵育后，去除游离的凋亡胸腺细胞。加入荧光标记的抗CD11b抗体，该抗体可结合巨噬细胞上的CD11b分子。

使用荧光显微镜观察不同荧光标记的巨噬细胞内呈荧光的凋亡胸腺细胞，以指示胞葬作用的发生。

凋亡胸腺细胞浓度较高的孔中，内化胸腺细胞数量增加。

打开未处理的 C57/Black-6 小鼠胸腔后，用弯头精细镊子取出胸腺。将器官置于含有 10 毫升 RPMI-1640 培养基的组织培养皿中。将整个胸腺在两张载玻片的磨砂端之间研磨，然后将所得组织悬液通过 70 微米细胞滤网过滤至 50 毫升离心管中。通过离心收集胸腺细胞，并将沉淀重悬于 40 毫升溶液中。

计数后，再次离心细胞，并将最多 2 × 10⁸ 个细胞重悬于每 50 毫升离心管中 20 毫升新鲜 PBS 中。每管用 20 毫升 PBS 中含 5 微摩尔 CFSE 对细胞进行标记。轻轻倒置管子 2 至 3 次以混匀，然后在室温避光条件下孵育胸腺细胞，时间不超过 2 分钟。孵育结束后，加入 10 毫升热灭活马血清终止反应，并通过离心收集细胞。

将标记的细胞重悬于40毫升新鲜PBS中，进行计数和离心，随后用40毫升培养基再洗涤一次。在培养基洗涤后，将胸腺细胞重悬于组织培养基中，浓度为每毫升7 × 10⁶ 个细胞，并将细胞接种至100毫米组织培养皿中。然后，向细胞培养物中加入星形孢菌素，使其终浓度为1微摩尔，并将培养皿置于组织培养箱中孵育4小时。

分离腹腔巨噬细胞时，在第0天向两只C57/Black-6小鼠腹腔内注射1毫升3%的陈旧巯基乙酸盐溶液，然后在第5天切开腹部皮肤，注意不要损伤腹膜。

为冲洗腹腔，使用带有18号针头的10毫升注射器，迅速将10毫升洗涤缓冲液注入腹腔，随后缓慢吸取洗涤缓冲液，并收集至50毫升离心管中。用PBS洗涤腹腔灌洗液两次。将腹腔巨噬细胞重悬于组织培养基中，浓度为每毫升含2 × 10⁶个细胞。

接下来，将500 µL的巨噬细胞接种至24孔板的每个孔中，将该板放入组织培养孵箱中孵育2小时。孵育结束后，吸除上清液以去除未贴壁的悬浮细胞，并向每孔中加入500 µL组织培养基。

立即将 0 至 12 × 10⁶ 个胸腺细胞加入 500 µL 培养基中，接种至培养板的每孔中，并将培养板置于组织培养箱中孵育 4 小时。孵育结束后，用新鲜 PBS 每孔洗涤两次，以去除所有游离的凋亡细胞，随后用染色缓冲液洗涤一次。接着，每孔加入含适量抗 CD11b 抗体的 200 µL 染色缓冲液，对贴壁巨噬细胞进行标记，并将培养板置于 4 °C 下孵育 20 分钟。