0 次观看 • 3:14 分钟 • July 8th, 2025
取一株金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的培养物，该致病菌可分泌白细胞毒素——一种由单体S组分和F组分构成的成孔毒素。
离心收集细胞，对上清液进行连续稀释。将含有杀白细胞素的上清液转移至含有多形核白细胞（PMNs）的微孔板中，孵育。
S 组分结合到中性粒细胞（PMN）上的特定跨膜受体，随后与 F 组分发生异源寡聚化，插入细胞膜，导致孔道形成。
孔道导致细胞内钾离子减少，从而激活含吡啶结构域的NLR家族蛋白3（NLRP3）。
NLRP3 与含有半胱天冬酶募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白（ASC）结合，进而招募前体半胱天冬酶-1，形成炎性小体。
自剪切将前体caspase-1转化为活化的caspase-1，从而触发细胞死亡。
在规定的时间点收获细胞。加入碘化丙啶（propidium iodide 或 PI），该染料可透过死细胞的破损膜进入细胞并与 DNA 结合，产生荧光。
采用流式细胞术定量分析经碘化丙啶（PI）染色的细胞，以评估两种杀白细胞素浓度及孵育时间的细胞毒性效应。
实验前一天，在适当的培养基中接种 S. aureus，于37摄氏度摇床培养箱中过夜培养。将过夜培养的细菌用新鲜培养基按1:100比例稀释，对 S. aureus 进行传代培养。在37摄氏度条件下振荡培养，直至细菌达到早期稳定生长期。培养5小时后，取1毫升传代培养的 S. aureus 转移至1.5毫升微量离心管中，在室温下以5000 g 离心5分钟。
离心后，吸除上清液。将吸出的上清液通过0.22微米针头滤器过滤至新的1.5毫升微量离心管中，并置于冰上。用冰上预冷的培养基对上清液进行系列稀释，该培养基用于培养Staph aureus。按照前述方法，将上清液样品或仅培养基（分别作为阴性对照和阳性对照）轻柔地加入含有PMNs和冰的96孔板的各个孔中。
轻轻摇动培养板以混匀上清液并分布到各孔中，在 37 摄氏度下孵育。在预定时间点，将培养板从培养箱中取出，置于冰上。向每根流式细胞术管中加入 300 µL 含有 1 µL 碘化丙啶的预冷 DPBS。将样品转移至置于冰上的流式细胞术管中。对于阳性对照孔，在转移至流式细胞术管前，向样品中加入 20 µL 10% 的 Triton X。使用流式细胞术分析中毒性 PMN 的碘化丙啶染色情况。