细胞毒性检测 金黄色葡萄球菌 吞噬作用后中性粒细胞所受应变

选取毒力较强和毒力较弱的Staphylococcus aureus菌株。

加入血清以对细菌进行调理。

将浓度逐渐增加的细菌转移至含有中性粒细胞的预冷多孔板孔中。低温可防止中性粒细胞活化。

离心以促进同步吞噬作用。

中性粒细胞受体结合调理素，触发细菌被内化至吞噬体中。

在致病性细菌中，吞噬体环境会诱导溶细胞毒素的表达。

这些毒素形成孔道，破坏吞噬体并损害中性粒细胞膜的完整性。

然而，毒力较弱的细菌表现出溶细胞毒素表达的下调。

孵育结束后，将中性粒细胞剥离并转移至含有荧光碘化丙啶（PI）染料的流式管中。

染料进入细胞膜受损的中性粒细胞，并对DNA进行染色。

使用流式细胞仪分析中性粒细胞的碘化丙啶（PI）染色情况。

与毒力较弱的菌株相比，中性粒细胞吞噬毒力强的菌株后，PI阳性中性粒细胞比例随浓度增加而上升，表明该毒力强的菌株对中性粒细胞具有细胞毒性。

当传代培养的Staph aureus达到对数生长中期时，取1毫升菌液转移至1.5毫升微量离心管中，在室温下以5000 g离心5分钟。用移液枪小心吸除上清液（勿扰动沉淀），将沉淀的细菌重悬于1毫升DPBS中。涡旋振荡样品30秒。在室温下以5000 g再次离心5分钟。

为了对金黄色葡萄球菌（Staph aureus）进行调理，首先将细菌沉淀重悬于1毫升20%的人血清中。然后，在37摄氏度下振荡孵育样品15分钟。按照前述方法，经离心后洗涤已调理的金黄色葡萄球菌（Staph aureus）。用预冷的RPMI将调理后的金黄色葡萄球菌（Staph aureus）菌株稀释至每毫升1 × 10⁸个菌落形成单位（CFUs），涡旋混匀30秒后置于冰上。

通过将细菌在琼脂平板上进行1到10倍的系列稀释，确认本实验所用金黄色葡萄球菌（Staph aureus）的浓度。从步骤1.14中取出置于冰上的含PMNs的96孔板，每孔轻柔加入100微升各金黄色葡萄球菌（Staph aureus）菌株或RPMI培养基，分别作为阳性和阴性对照。轻轻摇动培养板，使金黄色葡萄球菌（Staph aureus）在孔中均匀分布。

通过在4摄氏度下以500 g 离心8分钟使吞噬作用同步，并在离心后立即于37摄氏度孵育培养板，此时间点记为0。在预定的时间点，将培养板置于冰上，向每根流式细胞术管中加入200微升含1微升碘化丙啶的冰冻DPBS，然后将样品转移至对应的管中。