在培养的巨噬细胞中评估Leishmania Virulence

从含有置于盖玻片上的骨髓来源巨噬细胞的多孔板开始。

用利什曼原虫前鞭毛体（Leishmania promastigotes）处理巨噬细胞——即该寄生虫的感染阶段。

孵育期间，寄生虫与巨噬细胞相互作用，促进在相互作用位点周围组装F-肌动蛋白。

巨噬细胞通过富含F-肌动蛋白的吞噬体吞噬寄生虫，形成容纳寄生虫的空泡（parasitophorous vacuoles，PVs），即寄生虫的复制微环境。

在寄生泡内，寄生虫释放生存因子，增加泡周F-actin的聚集，并抑制其与溶酶体的融合。

此外，寄生虫会上调铁调素（hepcidin）的产生——一种巨噬细胞肽类激素，可抑制铁的释放并提高细胞内铁水平。

铁离子流入液泡可促进前鞭毛体向致病性无鞭毛体的分化，并促进其增殖，从而增强毒力。

孵育结束后，洗涤以去除游离的寄生虫，然后固定并通透感染的巨噬细胞。

加入核酸荧光染料，以染色感染的巨噬细胞和无鞭毛体的细胞核。

在荧光显微镜下，围绕巨噬细胞大细胞核聚集的小细胞核证实了细胞内寄生虫的存在，表明Leishmania具有毒力。

培养第7天或第8天，使用连接至真空管路的吸头，将四个经高压灭菌的12毫米玻璃盖玻片转移至6孔培养板每个孔的底部，避免重叠。为实验的每个时间点准备相同的培养板。随后，用新鲜的37摄氏度PBS洗涤骨髓来源巨噬细胞培养物2次，每次加入不含钙和镁并添加1毫摩尔EDTA的5毫升PBS。

在37摄氏度孵育5分钟后，将脱落的细胞收集至一个50毫升的圆锥形离心管中，每块培养板用额外的5毫升不含钙和镁的PBS冲洗两次。离心后，将巨噬细胞重悬于5至10毫升冰上预冷的新鲜骨髓来源巨噬细胞培养基中。计数后，用新鲜骨髓来源巨噬细胞培养基将细胞稀释至每毫升5 × 10⁵ 个细胞的浓度，并向6孔板的每个孔中加入2毫升细胞悬液。随后，将细胞在细胞培养孵箱中过夜孵育。

为了用亚马逊利什曼原虫（L amazonensis）感染细胞，将寄生虫悬液稀释至适当的实验感染复数，并向包括实验所有时间点在内的六孔板的每孔中加入50至100微升寄生虫悬液。将骨髓来源的巨噬细胞在适当的感染时间和温度条件下进行孵育。

随后，用每孔2毫升新鲜的37摄氏度、不含钙和镁的PBS洗涤各孔三次，并用1.5至2毫升的2%多聚甲醛固定初始时间点的样本，固定10分钟。对于对应后续时间点的培养板，向每孔加入2毫升新鲜的骨髓来源巨噬细胞培养基，并将培养板放回相应的培养箱中。然后，按照上述方法对每个剩余时间点的细胞进行固定和洗涤，并将样本保存在4摄氏度的新鲜PBS中。

为了用 DAPI 对细胞进行染色，将上清液替换为 1.5 ml 不含钙和镁的新鲜 PBS，加入 0.1% 非离子型去垢剂，在室温下孵育 10 分钟，随后用不含钙或镁的 PBS 洗涤三次，每次 2 毫升。接着，将细胞在 1 毫升 PBS 中加入终浓度为每毫升 2 微克的