真核细胞内Coxiella突变株胞内生长能力的评估

取一个含贴壁上皮细胞的多孔板，用绿色荧光蛋白标记的Coxiella突变株进行处理；其中一些突变株在IV型分泌系统基因（T4SS基因）上存在突变——该基因对复制至关重要。

复制型突变体与上皮细胞相互作用，触发Coxiella被吞噬，形成含Coxiella的空泡（CCV），并将溶酶体相关膜糖蛋白-1（LAMP1）募集至CCV。

这有助于效应蛋白分泌到细胞质中 通过 IV型分泌系统，促进细菌复制。

T4SS基因突变的突变体仍无法复制。

孵育后，用荧光染料对细胞进行染色，固定细胞并通透细胞膜。

加入与 CCV 上 LAMP1 蛋白结合的 LAMP1 特异性一抗。 

使用红色荧光染料标记的二抗孵育，与一抗结合，同时用Hoechst染料对细胞进行染色' 细胞核

在落射荧光显微镜下，靠近细胞核的红色荧光液泡内含有较少的绿色Coxiella，表明Coxiella突变体的复制存在缺陷。

然而，细胞内含有大量绿色Coxiella的液泡表明复制型Coxiella突变株成功实现了细胞内生长。

根据文本方案，用RPMI培养基制备每毫升含10⁵个细胞的Vero细胞悬液后，取100微升该悬液加入至平底透明黑色96孔板的每个孔中。以400 × g 在室温下离心5分钟，并在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜。

次日，在室温下解冻含有 Coxiella 突变株的96孔板，取150微升细菌悬液加入到深孔96孔板中，用不含酚红和胎牛血清的RPMI培养基稀释至300微升。随后，移除Vero细胞中的培养基，每孔加入100微升稀释后的 Coxiella 突变株悬液。以A1孔作为阴性对照，A2和A3孔作为阳性对照。

使用气溶胶密闭的离心板架，在室温下以400 × g 离心10分钟。随后，将板置于含5%二氧化碳的湿润环境中，于37摄氏度孵育2小时，然后将含有细菌的培养基更换为每孔100 µL新鲜的完全RPMI培养基。使用荧光酶标仪及荧光素滤光片，每天检测一次GFP荧光，持续七天。

感染后第七天，移除培养板中的培养基，每孔加入含1:1000稀释度细胞通透性荧光染料的新鲜完全培养基50 µL。将细胞孵育30至60分钟。孵育结束后，弃去原培养基，每孔加入50 µL含4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液。室温孵育30分钟，随后移除含PFA的缓冲液，并用PBS洗涤孔板三次。

除去最后一次洗涤液后，向每孔加入50微升封闭液，在室温下孵育30分钟。随后，弃去封闭液，每孔加入40微升新鲜封闭液以及1:500稀释的抗LAMP1抗体。室温孵育30分钟后，移除溶液，并使用板洗机用每孔100微升的PBS洗涤5次。

然后，每孔加入 40 µL 含有适当荧光二抗和 5 µg/mL Hoechst 33258 的封闭液。室温孵育 30 分钟。用 PBS 洗涤样本 5 次，最后一次洗涤后在孔中保留 PBS，以防止样本干燥。进行图像采集时