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免疫学
0 次观看 • 5:28 分钟 • July 8th, 2025
从内皮细胞的培养开始。
更换为厌氧培养基，在厌氧培养箱中孵育以达到温度平衡。
加入牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis），一种致病性厌氧细菌，短暂孵育。
细菌具有称为菌毛的蛋白质突起，可与内皮细胞上的特定黏附分子结合，从而促进细菌的黏附。
这种结合会触发细胞内信号级联反应，导致肌动蛋白细胞骨架重排以及细菌被吞噬进入吞噬体。
孵育结束后，移除培养基，用厌氧缓冲液洗涤以去除未黏附的胞外细菌。
加入温和的去污剂以通透宿主细胞膜并诱导细胞裂解，从而释放出被内化及附着在细胞表面的细菌，同时避免造成损伤。
用培养基稀释含有细菌的裂解液，并制备系列稀释液。
将这些稀释液接种到血琼脂平板上。在厌氧条件下孵育，以促进牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）增殖并形成菌落。
孵育结束后，计数每块平板上的菌落形成单位（CFUs），以定量表面附着和内化的细菌，从而反映细菌与宿主细胞之间的相互作用。
在培养和实验中使用Porphyromonas gingivalis时，需维持一个含有人工气氛的乙烯厌氧室，其中包含80%氮气、10%氢气和10%二氧化碳。
提前24小时将30个血琼脂平板、500毫升PBS以及VEGF培养基（血管内皮生长因子培养基）放入厌氧室，以平衡试剂。
在六孔板中，每孔接种4×10⁵个人类脐静脉内皮细胞（HUVECs），加入含VEGF的培养基，置于细胞培养箱中过夜，以促进细胞贴壁。按照随文所述方法，在脑心浸液（BHI）培养基中培养牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis），并在培养物于660纳米处的光密度值达到0.5至0.7之间时，使其进入对数生长期。
将细菌转移至15毫升离心管中，并用封口膜包裹管盖以防止接触氧气。随后，在5,000 × g 条件下离心10分钟。在厌氧工作站内，用厌氧磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤菌体沉淀，再以5,000 × g 离心10分钟。将细菌重悬于VEGF培养基中。
感染HUVECs Porphyromonas 牙龈卟啉单胞菌, 将六孔板从培养箱转移至厌氧舱内。吸除检测孔中的培养基，并用厌氧PBS洗涤三次。
通过台盼蓝排斥法测定一个代表性孔中的细胞数量。然后，每孔加入 2 毫升厌氧 VEGF 培养基，将培养板置于 37°C 厌氧培养箱中平衡 20 分钟。
测定细菌的光密度，并将其重悬于适量的VEGF培养基中，以感染复数为100:1（细菌与细胞比例）的条件感染细胞。将细菌悬液加入细胞中，在37摄氏度下孵育30分钟以完成感染。对于细胞裂解，在厌氧舱内用BHI培养基配制1%（重量/体积）的皂苷溶液，并通过0.2微米滤膜过滤。
为了研究细菌与宿主细胞的相互作用，从培养箱中取出六孔板并吸除感染培养基。用厌氧 PBS 洗涤三次。然后，向每孔加入 2 毫升皂苷溶液，孵育 15 分钟以使细胞裂解。
接下来，刮取细胞从孔底部，并用BHI培养基将细胞裂解液按1:1比例稀释。然后从1:100开始进行系列稀释。取200 µL适当稀释度的样品涂布于血琼脂平板上。用Parafilm封口膜包裹平板，在37°C厌氧培养箱中培养七天，以形成菌落。随后使用透射光灯计数每个平板上的菌落形成单位（CFU）。