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首先悬浮活跃生长的牙龈卟啉单胞菌,厌氧病原菌。
添加 BCECF-AM,一种非荧光、细胞渗透性染料。
活性细胞质酯酶将染料水解成荧光、细胞不渗透的形式,对细菌进行染色。
离心机。将细菌重悬于厌氧培养基中。
将
标记的细菌添加到含有带有粘附人内皮细胞的盖玻片的多孔板孔中。
在厌氧室中孵育。
细菌菌毛与内皮细胞表面受体结合,启动细胞内信号级联反应。
这导致肌动蛋白重排和吞噬体内的细菌内化。
孵育后,用缓冲液洗涤盖玻片以去除未内化的细菌。
用多聚甲醛固定细胞以保留细胞结构。用非离子去污剂透化细胞以访问细胞内靶标。
添加荧光标记的鬼笔环肽,它与肌动蛋白丝结合。
将
盖玻片放在含有 DAPI 的封片介质上,DAPI 会染色 DNA。
用
荧光肌动蛋白观察内皮细胞内的荧光牙龈卟啉单胞菌,确认细菌内化。
为了可视化内化细菌,首先,将高压灭菌的玻璃盖玻片无菌转移到 12 孔板的每个孔内。在盖玻片上每孔接种 5 次 10 到 4 个 HUVEC,并孵育 24 小时。为了标记细菌,离心对数中期细菌,并用厌氧PBS重悬沉淀。再次离心,重复洗涤步骤。
将 20 微升 0.2 毫摩尔 BCECF-AM 加入两毫升厌氧 PBS 中,每毫升含有 5 至 7 倍 10 至 8 个细菌。在37摄氏度下在黑暗中孵育30分钟。
我们使用的荧光染料可以对大多数厌氧菌进行染色。因此,不需要其他试剂,例如特异性抗体。
将
细菌悬浮液以5,000倍g离心10分钟,除去未结合的标记试剂,并将细菌重悬于VEGF培养基中。然后,以100比1的比例感染HUVEC细胞,细菌与细胞,并在37摄氏度下孵育30分钟。孵育后,除去感染培养基,并用PBS洗涤细胞三次。然后,加入4%多聚甲醛,在室温下孵育10分钟,将细胞固定在厌氧室中。
从
腔室中取出固定细胞,然后用PBS洗涤盖玻片三次。将盖玻片在一毫升0.2%Triton X-100中孵育10分钟,以透化细胞。然后,用PBS清洗盖玻片三次。现在,向每个盖玻片中加入每毫升 50 微克 TRITC 鬼笔环肽 50 微升,并在室温下孵育 45 分钟以染色细胞寡聚肌动蛋白。
孵育后,用PBS洗涤盖玻片3次。使用含有每毫升 DAPI 一微克的软固性封片介质将盖玻片倒置在载玻片上,用于核染色。然后,用指甲油密封盖玻片的外围,并在共聚焦显微镜下观察。