结核分枝杆菌感染巨噬细胞亚群的流式细胞术染色

从具有特定表面标志物的贴壁M1和M2巨噬细胞亚群开始，这些细胞被荧光标记的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）感染。

向培养孔中加入 FACS 缓冲液。

缓冲液中的EDTA可使细胞从培养孔中脱离。

将细胞悬液转移至微量离心管中。

将离心管离心。弃去上清液。用荧光染料标记的抗巨噬细胞抗体混合物和活力染料Zombie-UV重悬细胞。

Zombie-UV 荧光染料通过受损的细胞膜进入死细胞，并与胞质蛋白结合，从而能够清晰区分未染色的活细胞。

此外，荧光标记的抗巨噬细胞抗体可结合巨噬细胞上的靶抗原，从而实现对不同亚群的差异性检测。

洗涤细胞以去除未结合的抗体。离心。移除上清液。

将细胞重悬于固定缓冲液中，以交联蛋白质，保持细胞形态，并灭活分枝杆菌，确保在分析过程中安全操作。

最后，离心并处理样品用于流式细胞术分析。

采用适当的设门策略来确定感染Mycobacterium的亚群百分比。

为进行流式细胞术染色，将感染的细胞与每孔含0.5毫摩尔EDTA的1毫升FACS缓冲液在每个孔中孵育至少30分钟。孵育结束后，轻轻吹打使细胞脱落，收集细胞并转移至单独的螺口微量离心管中，进行离心。

将细胞重悬于约 50 微升含荧光染料标记的抗人抗体混合物及所需活力染料中，在 4 摄氏度避光孵育 30 分钟。

洗涤后，在避光条件下，用200微升新配制的固定缓冲液在室温下固定细胞30分钟。固定并洗涤后，将细胞重悬于400微升FACS缓冲液中，并将细胞转移至1毫升微量离心管中。

为分析细胞，使用补偿微珠对混合抗体中每种荧光染料偶联抗体的荧光信号进行补偿，并使用未染色细胞设定阴性细胞群的设门范围。然后，每样本至少采集 50,000 个细胞。