0 次观看 • 5:27 分钟 • July 8th, 2025
取一培养含有荧光标记的细胞质蛋白的癌细胞。
加入细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）——具有自然杀伤细胞样特性的效应T细胞——其具备抗肿瘤活性。
CIK 细胞上的自然杀伤细胞受体 2D（NKG2D）受体与癌细胞上的应激诱导蛋白结合。
这种结合会诱导CIK细胞释放胞质颗粒毒素——穿孔素和颗粒酶。
穿孔素在癌细胞膜上形成孔道，使颗粒酶进入细胞，激活半胱天冬酶，从而诱导细胞凋亡。
孵育结束后，收集细胞。加入荧光核酸结合的细胞活力染料。
染料通过受损的细胞膜进入细胞，并与DNA结合，从而产生双重染色的死细胞。
细胞膜完整时，活细胞对染料不具有通透性。
通过流式细胞仪检测显示单一荧光的活细胞和具有双荧光的死细胞。
创建散点图以测量死亡癌细胞的百分比，量化CIK细胞的细胞毒性作用。
进行细胞毒实验时，将CIK细胞与人慢性髓系白血病K562细胞共培养：在6孔板中每孔加入1毫升K562细胞，细胞密度为每毫升50万个细胞。然后，根据文本方案所述，向6孔板中每孔加入1毫升基础培养基，有或无CIK细胞。通过轻轻吹打细胞悬液至少三次，使其充分混匀。
将培养板放入培养箱中孵育24小时。现在，通过向6孔板中加入1毫升基础培养基（含或不含CIK细胞）与CIK细胞和卵巢OC-3细胞共培养，具体操作如文本方案中所列。在培养箱中孵育24小时期间，使用移液器轻轻吹打细胞悬液至少3次以混匀细胞悬液。孵育结束后，直接将CIK-K562细胞悬液收集至15毫升无菌离心管中。
为收获CIK-OC-3组中的悬浮细胞和贴壁细胞，首先将细胞悬液转移至15毫升无菌离心管中。用1毫升无菌PBS洗涤培养孔，收集PBS并加入该离心管中。随后加入0.5毫升细胞解离酶溶液，在37摄氏度下孵育5分钟。
向对应孔中加入来自同一试管的1毫升溶液，并使用1毫升无菌移液器上下吹打至少三次，轻柔混匀细胞。将所有细胞收集至同一试管中。在300 × g 条件下离心10分钟。吸去上清液，将细胞重悬于1毫升无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中。在300 × g 条件下再次离心10分钟。然后吸去上清液，将细胞重悬于100微升无菌PBS中。
向细胞悬液中加入 5 µL 的 7-AAD 染料。使用 1 mL 无菌移液枪轻柔吹打细胞至少 3 次，充分混匀。室温避光孵育 10 分钟，然后进行分析。
为进行细胞溶解能力检测，将细胞悬液混合并重复流式细胞术的制备步骤。单击新建样本按钮，以向实验中添加样本和试管。按照文本方案中列出的名称对试管进行命名。
为了为细胞毒性实验建立散点图门控系统，首先选择 Tube 1，然后点击 Dot Plot 按钮。创建 FSC-A/SSC-A 图时，绘制一个矩形门，覆盖所有 FSC-A 阈值大于 50,000 的事件，以排除细胞碎片。为新散点图选择 SSC-A/CFSE 参数。然后，为新的散点图选择 7-AAD/CFSE 参数，并绘制一个四象限门以定义四个亚群。
首先点击加载样本按钮，分析空白对照样本。调节SSC-A和FSC-A的电压。利用CFSE和7-AAD通道参数识别死细胞群体。记录每份样本中超过20,000个CFSE阳性细胞的数据。打开包含各单个样本统计值的文件，以分析非活细胞群体，并将数据导出至分析文件中。