体外粘附实验检测癌细胞对中性粒细胞胞外诱捕网的粘附

在肿瘤微环境中，活化的中性粒细胞会释放中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），其由细胞外DNA纤维、组蛋白和颗粒蛋白组成，在肿瘤进展中发挥关键作用。

研究癌细胞与中性粒细胞胞外诱捕网的黏附 体外，将NET悬液加入多孔板孔中，孵育以形成NET单层。

孵育后，去除未贴壁的NETs。

加入蛋白溶液以封闭孔板中的游离结合位点。

将荧光标记的癌细胞用移液管加至 NET 单层上方。

癌细胞上的特异性表面受体与中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）相互作用，促进细胞黏附。

孵育后，弃去阴性对照孔中的培养基。

加入脱氧核糖核酸酶以降解 NETs，使细胞脱离。

移除阴性对照孔和检测孔中的溶液。使用缓冲液洗去未贴壁的细胞。

用甲醛将贴壁癌细胞固定在中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）上。

使用荧光显微镜观察黏附在中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）上的荧光标记癌细胞。

检测孔显示癌细胞对中性粒细胞胞外陷阱（NETs）有显著黏附，而经脱氧核糖核酸酶处理的NETs则表现出癌细胞黏附水平降低。

向96孔平底板的每个孔中加入100微升NET储存液，并在4摄氏度避光条件下孵育过夜，以包被孔板。12至20小时后，使用显微镜检查各孔底部是否形成均匀的无细胞NET单层。确认单层形成后，轻柔吸出孔中所有未结合的物质，注意避免破坏底部的单层结构。

这是该实验操作中最关键的环节。为了维持足够完整的 NET 单层结构，必须非常小心地操作培养板。所有试剂和细胞均需沿孔壁缓慢加入。抽吸时动作务必轻柔，并避免吸头接触孔底。

去除非黏附物质后，每孔轻轻加入 100 微升 1% 牛血清白蛋白封闭液，在室温下孵育 1 小时。切勿振荡或摇动培养板，以免破坏 NET 单层结构。

接下来，当A549癌细胞生长至70%至80%汇合时，采用标准技术收集细胞。将细胞重悬于培养基中，浓度为每100微升含2 × 10⁴个细胞。通过在每毫升培养基中加入1微升CFSE对细胞进行染色，并在室温下孵育10分钟。

接着，在4°C条件下，以450 × g 离心力离心细胞5分钟。弃去上清液，并将细胞重悬于初始体积的培养基中，以维持每100 µL培养基中含有2 × 10⁴ 个癌细胞的浓度。

取 NET 包被的培养板，轻柔吸除封闭液。然后，向每孔加入 100 微升癌细胞悬液，在 37 摄氏度及 5% 二氧化碳条件下孵育 90 分钟，使细胞贴附于板上。

完全吸出液体，向部分孔中加入 1,000 单位的 DNase I，作用 10 分钟以降解 NETs。在其他孔中，每孔加入 100 微升无菌水，作用 10 分钟，作为溶剂对照。随后，轻柔地吸出各孔中的液体，并用 100 微升 PBS 洗涤，以去除所有未贴壁的 A549 细胞。

吸出并弃去各孔中的全部溶液，仅保留底部的中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）及贴壁的癌细胞。随后，每孔加入100微升4%的甲醛溶液以固定细胞。立即将培