利用磷酸流式细胞术评估基质细胞因子诱导的细胞内蛋白磷酸化

将白血病细胞置于不含细胞因子等刺激因子的生长培养基中，并进行培养。

缺乏刺激因素使得细胞内磷酸化蛋白发生去磷酸化，并恢复至其天然状态。

离心并移除培养基。用含有细胞因子胸腺基质淋巴细胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）的基质上清液重悬细胞。

TSLP 与其受体结合于白血病细胞上，触发受体二聚化。

这使得两个与Janus相关的激酶（JAKs）相互靠近，促进彼此的转磷酸化。

活化的JAKs磷酸化受体的胞内尾部，从而为信号转导子和转录激活子（STAT）单体创造停泊位点。

一旦被磷酸化，STAT 蛋白便会二聚化并从受体上解离，进而调控下游的细胞过程。

固定细胞以维持细胞内蛋白质的磷酸化状态。

使用透化溶液处理细胞，以增加细胞膜的通透性。

加入荧光标记的抗体以标记磷酸化蛋白。

流式细胞术检测的荧光信号与TSLP诱导的STAT磷酸化水平相关。

为了验证由工程化基质细胞产生的上清液，将从表达细胞因子的对照基质细胞中收集的上清液样本解冻，并在96孔组织培养板中，每种条件下接种3个复孔的白血病细胞系，使用R20培养基，细胞浓度为每孔2 × 10⁵个细胞。在37°C下孵育细胞2小时，以消除细胞在前一培养阶段中的磷酸化状态。

然后，将每个孔中的细胞转移至单独的4毫升离心管中，通过离心收集细胞。根据每个实验条件，将细胞沉淀重悬于600微升溶液中，并将每种条件下的200微升细胞悬液以每孔三复孔的方式接种到培养板中。根据特定的商用磷酸化检测试剂盒要求，将细胞孵育适当的时间。

孵育结束后，通过离心收集细胞沉淀，并对细胞进行标记 通过 根据制造商说明书进行磷酸化流式细胞术染色。然后，采用标准流式细胞术分析方案对细胞进行流式细胞术分析，以验证基质上清液中的细胞因子可磷酸化白血病细胞。