在支撑脂双层上自然杀伤细胞免疫突触形成的超分辨率成像

制备一个带有由磷脂和生物素化磷脂组成的支撑脂双层（SLB）的腔室载玻片。

加入封闭蛋白以防止非特异性相互作用。

加入链霉亲和素，其可与生物素化的磷脂结合。

加入与固定的链霉亲和素结合的生物素化荧光标记抗-CD16抗体。

加入D-生物素以防止链霉亲和素与细胞发生非特异性结合。

介绍自然杀伤细胞，即NK细胞。这些细胞上的CD16受体特异性结合SLB上固定的抗CD16抗体，形成免疫突触。

这种结合会触发肌动蛋白重排和微管极化，最终在突触中心形成微簇，其中包含SLB结合的抗CD16抗体和CD16受体。

含有穿孔素的溶细胞颗粒在突触处极化，并穿透肌动蛋白丝。

固定细胞。对细胞膜和支撑脂质双层膜（SLB）进行透化处理。

加入荧光标记的鬼笔环肽和抗穿孔素抗体，它们分别与肌动蛋白丝和穿孔素结合。

使用超分辨率荧光显微镜，观察荧光标记的肌动蛋白丝和穿孔素阳性颗粒在突触处的分布。

为了组装玻璃支撑的平面脂质双层，首先在烧杯中按1比3的比例混合30%过氧化氢与硫酸，制备100毫升的食人鱼溶液。将两片矩形#1.5盖玻片放入该溶液中，浸泡20至30分钟。在盖玻片清洗的同时，取出一支预先制备的400 µM DOPC脂质管和一支预先制备的80 µM Biotin-PE脂质管，并将其置于冰上运送至氩气罐处。

用氩气对新的微量离心管进行脱氧后，按1:1的比例加入DOPC和Biotin-PE。具体体积根据实验需求而定，但每种至少应为2 µL。在将试剂管放回冰箱前，需对混合管以及各个试剂管进行脱氧处理。

清洗完毕后，用蒸馏水彻底冲洗盖玻片，并将盖玻片放置于空气中干燥数分钟。然后，吸取1.5 µL脂质体混合物，以单滴形式加入玻片腔室的一个通道中。每个通道使用两滴是常见做法，但并非必需。

现在，迅速而高效地将干燥的盖玻片覆盖在液滴上。确保液滴之间留有足够间距，以免盖玻片放置后液滴相互融合。此外，需保证液滴保持圆形且轮廓清晰，不与腔室壁的边缘接触。在各通道之间及周围用力下压，确保盖玻片与载玻片之间形成严密的防水密封。

使用记号笔标记液滴的位置。然后，向腔室中通入100微升5%的水相酪蛋白溶液，以封闭双分子层。注意确保流动腔室中无气泡。接着，向每条通道中注入100微升浓度为333纳克/毫升的链霉亲和素溶液。

室温孵育10至15分钟后，通过每条泳道加入3毫升含1%人血清白蛋白的HEPES缓冲盐溶液洗涤，以去除过量的链霉亲和素。按照文中所述实验方案，加入100微升生物素标记的荧光标记抗CD16抗体，其蛋白浓度为先前已确定的浓度。

在避光孵育20至30分钟后，通过每条通道加入3毫升含1%人血清白蛋白的HEPES缓冲盐水再次洗涤。然后，将浓度为25纳摩尔的D-生物素溶液100微升流经反应室，以结合任何过量的链霉亲和素，从而消除链霉亲和素与细胞发生非特异性结合的可能性。

接下来，计数人自然杀伤细胞（NK细胞），并将其重悬于含1%人血清白蛋白的HEPES缓冲盐溶液中，浓度为每毫升50万个细胞。用另一份每通道3毫升含1%人血清白蛋白的HEPES缓冲盐溶液洗去小室中的D-生物素。待细胞重悬至目标浓度后，向每通道加入100微升。将小室置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育30至60分钟。

孵育结束后，在室温下用4%多聚甲醛固定细胞10至20分钟。每孔加入3毫升磷酸盐缓冲液冲洗，以去除多聚甲醛。随后，每孔加入400微升封闭缓冲液，并在室温下孵育30分钟。

接下来，加入200微升稀释的荧光标记鬼笔环肽和荧光标记抗穿孔素单克隆抗体，对F-肌动蛋白和穿孔素进行染色。室温孵育1小时后，通过向腔室中注入3毫升磷酸盐缓冲液洗涤。腔室即可用于成像。

首先，开启 STED 显微镜的所有必要硬件模块。启动图像分析软件，并启用共振扫描和 STED 模块。完成这些设置后，等待约三到五分钟，使软件完成初始化。

单击屏幕顶部的配置选项卡。选择激光器配置。然后，打开白光和STED 592纳米激光器。选择100倍物镜，并使用592纳米耗尽激光对准激发激光束。选择激光器配置模块。关闭592纳米耗尽激光器，并打开660纳米耗尽激光器。

将载玻片放置在物镜上方的载物台上。使用白光灯和目镜，使固定在划定双层区域上的细胞对焦。然后，返回到Configuration选项卡右侧紧邻的Acquisition选项卡。单击Switch to White Light选项卡，接着打开该模块，并将激发激光线拖动至适当的波长。

选择所需的检测器并设置检测范围后，单击左侧 Acquire 工具栏中的 Sequential 按钮，以在左侧工具栏底部调出顺序扫描对话框。此功能允许用户添加多个序列，每个序列使用不同的激发光束对应不同的荧光颜色。在各帧之间进行切换，然后为每种额外的颜色设置激发波长、检测器和检测范围。当所有参数优化完成后，点击 Start 以开始图像采集过程。