基于琼脂糖的人类精密切割肺组织片制备

从一个切除的人肺开始。

将硅胶管插入肺的主支气管中，并固定该管，以便在后续步骤中通过此通路将琼脂糖引入组织。 

夹闭其他支气管和血管，以防止灌注过程中琼脂糖泄漏。

将预热的低熔点琼脂糖与培养基混合后注入肺部，直至肺完全膨胀。 

将肺组织置于冰上以促进琼脂糖聚合，形成固体凝胶基质，从而在切片过程中为组织提供支撑并维持肺部结构。

聚合后，将肺组织切成均匀的薄片，从组织薄片中提取圆柱形组织芯。

使用装有预冷缓冲液的组织切片机，将组织芯切成精密切割的肺片。

将切片转移至含有冷培养基的培养板中。孵育以稳定组织。

最后，将切片转移至含有培养基的多孔板中。制备好的精密切割肺切片现已可用于实验。

开始此操作时，通过插入硅胶管并用夹子将其固定，以实现气管插管，夹子应与硅胶管平行放置，使夹子将组织与硅胶管一起夹紧，但不压闭管腔。用夹子封闭所有其他支气管、血管和损伤部位，以防止在灌注过程中琼脂糖泄漏。

需要具备良好的解剖技能才能插管主支气管。肺组织不宜过度扩张，否则组织会受到牵拉；如果组织充盈不足，则会因组织过于柔软而无法制备任何肺切片（PCLS）。

然后，在烧杯中将等体积的3%低熔点琼脂糖与培养基混合，并使用50毫升注射器将混合液注入肺组织。在用培养基重新填充注射器之前，需用手指或夹子夹闭导管，以避免产生气泡以及无琼脂糖的液体流出。将肺组织切成3至5厘米厚的组织片。

用400毫升冰冷的EBSS填充组织切片机。立即使用配备取芯工具的半自动螺丝刀从肺组织切片中切出圆柱形组织芯。随后，将组织芯转移至组织切片机的组织 holder 中。将重物置于组织芯上方，开始将组织芯切成PCLS。通过打开玻璃圆筒上的夹子，使液体从组织切片机中排出至烧杯内。

接下来，将切片从烧杯转移至含有培养基的培养皿中。随后，将培养皿放入培养箱，使培养基在洗涤步骤前预热。然后，小心地将肺组织切片转移至24孔培养板中，每孔加入至少500 µL培养基，每孔放置两个切片。