一种用于评估抗荚膜抗体对荚膜细菌调理作用的调理-黏附检测法

取一份经化学灭活并用荧光标记的 Bacillus anthracis 悬液。

细菌荚膜主要由聚-γ-谷氨酸组成，可提供抗吞噬保护作用。

采集非人灵长类动物的血清，并通过加热灭活以破坏补体蛋白。这些血清来源于接种了细菌荚膜疫苗的动物，含有抗荚膜抗体。

将化学灭活的细菌悬液加入血清中。抗体特异性结合细菌荚膜，促进细菌的调理作用，并标记它们以便吞噬细胞清除。加入标准补体蛋白以增强调理作用。

将调理过的细菌转移至贴壁巨噬细胞——吞噬细胞中，短暂孵育。

细菌表面的抗体和补体蛋白分别与巨噬细胞的Fc受体和补体受体结合，促进细菌的黏附。

移除培养基。用缓冲液洗涤以去除未黏附的细菌。

固定细胞以保持细胞完整性。

使用荧光染料标记巨噬细胞。

使用荧光显微镜观察黏附在不同荧光标记的巨噬细胞上的荧光细菌，以确认抗荚膜抗体对细菌的有效调理作用。

用 PBS 清洗灭活的菌种三次，以去除固定剂。加入 FITC 溶液，终浓度为 75 微克/毫升。在 4 摄氏度下缓慢振荡混合物 18 至 24 小时。按前述方法再次清洗细菌，以去除多余的 FITC。

最后一次洗涤后，将分枝杆菌重悬于与初始体积相同的 PBS 中。分装后于 -20 摄氏度保存备用。取少量非人灵长类动物的待测血清，置于金属浴或 PCR 仪中，56 摄氏度加热灭活 30 分钟。将 FITC 标记的细菌解冻，并用 PBS 洗涤两次，每次在 15,000 × g 离心 3 至 5 分钟。然后将其重悬于与初始体积相同的 PBS 中。

在96孔圆底板中，用细胞培养基对检测血清进行连续稀释。在另一块96孔圆底板中，向每个孔加入10 µL稀释后的检测血清。然后，加入10 µL freshly reconstituted baby rabbit complement。

向3号培养板中加入适量体积的FITC标记的分枝杆菌，以实现感染复数为20，例如，对于50,000个细胞，加入含有50,000乘以20个分枝杆菌的体积。向3号培养板的每孔中补加适量细胞培养基，使总体积达到105微升。将3号培养板在37°C、5% CO2及湿润环境中孵育30分钟，以促进分枝杆菌的调理作用。

将含有贴壁细胞的1号培养板置于37摄氏度的加热块上。使用多通道移液器从孔中移除用过的培养基，并迅速加入来自3号培养板的100微升已调理的细菌，确保移液过程中孔内不产生气泡。为避免扰动细胞单层，加样时应将液体加至孔的侧壁。

将1号培养板在37摄氏度、5% CO₂及适宜湿度条件下孵育30分钟，以促进细胞贴壁。在37摄氏度加热板上，用150微升PBS对每孔清洗5次，以去除未贴附的杆菌。加样时将移液枪头置于孔壁侧面，确保清洗过程中细胞不被意外冲散。向每孔加入150微升4%多聚甲醛，固定细胞1小时。

用 PBS 洗涤细胞两次后，将 2 µL 高内涵筛选橙色细胞染料加入 10 mL PBS 中混匀。然后，向固定后的细胞中加入 150 µL 染色液，在常温下孵育 30 分钟。将 1 号培养板置于载物台上，使用明场或相差显微镜对细胞进行聚焦观察。

在采集选项卡中，选择96孔板型设置，然后选择通道设置。接着，将设置为拼接模式。指定需要采集的图像数量。将采集模式更改为黑白或单色，并将像素合并（binning）设置为至少2×2。开启自动对焦或对焦模块，并指定自动对焦功能的执行频率。

接下来，如果设备支持，开启 z 轴层扫功能，以设定 z 轴层扫数量，从而捕获细胞单层及附着分枝杆菌的厚度。指定用于保存图像的文件夹。随后运行自动成像程序。按照文本方案中所述进行数据采集与分析。