利用光激活型肽-MHC评估T细胞的可控激活

首先用生物素化的聚-L-赖氨酸包被盖玻片，以形成富含生物素的表面。

接下来，加入链霉亲和素——一种可与生物素结合的蛋白质，为后续相互作用形成分子桥梁。

随后，加入与主要组织相容性复合物——pMHCs以及黏附分子结合的生物素化光笼肽。

生物素化的pMHC配体和黏附分子与链霉亲和素上的特定位点相互作用，从而实现其固定化。

接着，用缓冲盐溶液反复洗涤盖玻片，并加入 T 细胞。

光笼基团是一种连接在肽链特定残基上的光敏化学基团，其存在会阻碍T细胞受体与肽的自发结合。

为了实现受控的T细胞激活，将光笼肽暴露于紫外光下。

紫外光打断光笼-肽复合物之间的化学键，暴露出肽的天然形式。

T细胞受体识别并结合暴露的肽段，而整合素则与黏附分子结合，从而触发T细胞活化。

首先，将生物素化的聚-L-赖氨酸（bio-PLL）用去离子蒸馏水按1:500比例稀释后加入8个8孔腔室盖玻片中。室温孵育30分钟。孵育结束后，用去离子蒸馏水洗涤，然后在室温下干燥2小时。

用含有2% BSA的HEPES缓冲盐溶液封闭液在室温下封闭生物素化PLL包被的表面30分钟。孵育结束后，移除生物素化PLL包被表面的封闭液，注意避免孔壁干燥。随后加入链霉亲和素，在4摄氏度下孵育。

孵育一小时后，用 HBS 洗涤包被的表面。将腔室载玻片的孔进行倒置并充满 HBS 4 至 5 次，以去除孔中的 HBS。切勿让孔干燥。

将特异性的生物素化光活化肽-主要组织相容性复合物配体以及针对CD4阳性T细胞或CD8阳性T细胞的黏附分子加入到生物素化聚赖氨酸（bio-PLL）包被的表面。避光孵育，在室温下孵育1小时。孵育结束后，按前述方法洗涤，并置于HBS缓冲液中直至准备接种细胞。最后，向相应的孔中加入200,000个表达适当TCR的CD4阳性或CD8阳性T细胞，在37°C条件下孵育15分钟，使细胞贴附。

待细胞贴附并铺展于表面后，即可进行光激活和成像。使用配备紫外兼容的150倍物镜的倒置全内反射荧光显微镜进行图像采集。分别采用488纳米和561纳米激发激光，同时在绿色和红色通道中监测探针信号。

安装含有T细胞的腔室载玻片后，根据需要调整显微镜设置，以获得TIRF或落射荧光照明。在实时模式下，选择表达目标荧光探针的细胞视野。利用软件控制，在单个细胞下方建立微米尺度的光激活区域。随后，开始图像采集。

通常，采集80个时间点，每个时间点之间间隔5秒。这样可在双色实验中为依次进行的488纳米和563纳米曝光留出时间。采集10个时间点后，通过打开数字光圈快门1至1.5秒，对选定区域进行光激活。延时成像完成后，选择新的细胞视野并重复该过程。