一种用于研究抗体体内分布的活体免疫荧光定位方法

以小鼠乳腺癌模型为例。乳腺肿瘤组织包含癌细胞、癌相关成纤维细胞、脂肪细胞、免疫细胞以及肿瘤血管系统。

静脉注射荧光染料偶联的肿瘤特异性抗体。

当抗体到达肿瘤血管系统时，会结合到血管内皮及邻近癌细胞上的肿瘤特异性跨膜蛋白。

手术分离乳腺组织，并将其浸入冷冻介质中。

将冷冻切片置于载玻片上，并用缓冲液冲洗以去除包埋介质。

固定切片以保存组织结构。使用去垢剂以增强免疫染色，并应用封闭液以防止抗体非特异性结合。

加入一种针对血管内皮细胞上黏附分子的特异性一抗，以及一种与一抗结合的荧光染料标记的二抗，从而标记血管系统。

在载玻片上添加封片剂，然后盖上盖玻片。

在共聚焦显微镜下，评估肿瘤特异性抗体在荧光标记的肿瘤血管内外的生物分布情况。

按照文本方案中所述进行麻醉后，准备对动物进行尾静脉注射抗体溶液。用酒精棉片擦拭动物尾部三次以消毒。使用加热垫加热约30秒使尾部静脉扩张；注意避免加热整个动物。使用27号尾静脉导管，将蝶形针插入两条侧尾静脉之一。

观察血液是否回流至导管中，以确认针头位置是否正确，从而确保溶液完全进入动物体内，而非滞留在尾部。

使用一段医用胶带将带有插入针头的尾巴小心地固定在载物台上。用 25 微升无菌磷酸盐缓冲液冲洗导管。然后，使用胰岛素注射器将抗体溶液注入导管中。再次用 25 微升无菌 PBS 冲洗导管。从尾巴上移除针头，并按压以止住任何出血。

按照文本方案中所述方法对小鼠实施人道安乐死，并将小鼠置于仰卧位。使用手术剪和镊子切除肿瘤组织。用镊子仅夹住靠近尾部那对乳腺组织之间最外层的皮肤，用手术剪做一小切口。将闭合的手术剪从切口插入，缓慢张开剪刀尖端，小心地将皮肤与下方腹壁膜分离，同时保持腹壁膜完整。

沿腹部向上做一纵向切口，继续将皮肤与内层膜分离。在第三和第四对乳腺之间，横向切开腹部，以便牵拉皮肤并暴露乳腺组织。用镊子夹住每个肿瘤或正常腺体，用手术剪小心剪除附着的皮肤。

将切除的组织放入预先标记并填充了最佳切割温度包埋介质的一次性组织基模中。将模具置于干冰上快速冷冻。为研究脱靶递送情况，需同时切除其他感兴趣的组织或器官。使用冷冻切片机将冷冻的组织块切成10微米厚度的切片，并将相邻切片转移至预先标记的黏附载玻片上。

用室温 PBS 冲洗冷冻组织切片 5 分钟，以去除包埋介质。使用疏水屏障笔标记组织切片区，以减少染色过程中所需溶液的用量。用 4% 多聚甲醛溶液固定组织切片 5 分钟。用 PBS 冲洗切片 5 分钟后，用含 0.5% Triton X-100 的 PBS 溶液对组织切片进行 15 分钟的通透处理。再次用 PBS 冲洗切片 5 分钟。

在室温下，用含有3%（重量/体积）牛血清白蛋白和5%（体积/体积）山羊血清的PBS封闭组织1小时。将切片用PBS冲洗5分钟后，加入具有记录功能的一抗（如常见的核、血管或胞质标记物）进行孵育。此处使用大鼠抗小鼠CD31抗体，按1:100的比例溶于封闭液中。将加有一抗的切片置于切片盒中，于4摄氏度避光孵育过夜，防止脱水。

孵育结束后，用 PBS 清洗载玻片，每次 5 分钟，共清洗三次，每次更换新的 PBS。随后将载玻片与二抗共同孵育，以标记一抗。在本实验中，使用 AlexaFluor-546 标记的山羊抗兔抗体标记抗 B7-H3 抗体，使用 AlexaFluor-488 标记的山羊抗大鼠抗体在封闭液中标记 CD31。将载玻片置于载玻片托盘中，室温下避光并防止干燥，孵育 1 小时。

按照之前的方法，将载玻片用 PBS 漂洗后，在组织切片中央滴加一滴封片剂。小心地盖上盖玻片，避免产生气泡。用透明指甲油密封盖玻片边缘，并使其干燥。随后按照文中所述实验方案进行共聚焦显微镜成像和定量图像分析。