定量流式细胞术检测人吞噬细胞对真菌孢子的吞噬作用

取一个含有人类白细胞悬液的多孔板，加入FITC标记的致病性真菌孢子。

孵育过程中，孢子会膨胀并破裂其刚性的疏水性蛋白层，暴露出可被吞噬细胞上特定模式识别受体识别的细胞壁多糖。

这种结合会触发细胞内信号通路，导致肌动蛋白重排以及孢子在吞噬体内的内化。

根据吞噬细胞的活化状态，部分孢子会附着在细胞上而不被内化。

孵育结束后，收集细胞并转移至新的离心管中。

离心。用缓冲液重悬细胞，并将其转移至V型底多孔板中。

加入荧光素标记的抗-FITC抗体，使其与附着孢子上暴露的FITC分子结合，从而对孢子进行复染。

离心。用缓冲液重悬细胞，并将其转移至流式细胞仪检测管中。

通过流式细胞术区分内化孢子与细胞表面黏附的孢子。

含有内化孢子的吞噬细胞显示 FITC 信号，而带有黏附孢子的细胞则同时呈现 FITC 信号和复染信号。

首先，将200万个白细胞和400万个FITC标记的分生孢子加入1.5毫升含10%胎牛血清（FCS）的RPMI培养基中，转移至12孔细胞培养板。设置仅含细胞而不含分生孢子的对照组，以及含未标记分生孢子的细胞对照组。将培养板置于37摄氏度、湿润且含二氧化碳的培养箱中孵育所需时间。孵育结束后，使用细胞刮刀收集细胞，并转移至15毫升离心管中。

首先，将每种样品和对照各 100 微升加入 96 孔 V 型底板的一个孔中。加入含有 2 毫摩尔 EDTA 的 150 微升 PBS 进行洗涤。为进行颜色补偿，在板的其他孔中每种荧光颜色分别加入不含分生孢子的 100 万个细胞。设置一个不加染料的细胞孔作为对照。每个孔均加入含有 2 毫摩尔 EDTA 的 150 微升 PBS 进行洗涤。

接下来，用粘性封口膜覆盖培养板，在室温下以300 × g 离心5分钟。然后，移除封口膜，将培养板在水槽或一次性纸巾上方迅速而有力地倒置一次，弃去上清液。用100 µL抗体混合液重悬细胞，并通过移液充分混匀。

进行颜色补偿时，将相应的细胞重悬于含有2毫摩尔EDTA的100微升PBS中，并向每个孔中加入与抗体混合物中相同用量的单一类型抗体。用粘性封口膜封住，室温避光孵育20分钟。

此后，移去封口膜，每孔加入含有 2 毫摩尔 EDTA 的 150 微升 PBS 进行洗涤。再次用粘性封口膜覆盖酶标板。在室温下以 300 × g 离心 5 分钟，然后移去封口膜，将酶标板快速而用力地倒置于水槽或一次性纸巾上方，弃去上清液。用含有 2 毫摩尔 EDTA 的 200 微升 PBS 重悬细胞，将每孔的细胞悬液分别转移至独立的圆底离心管中。

启动流式细胞仪并预热。在采集软件中创建新实验，设置并标记新样品。根据文本方案中所述，为相应的荧光染料设置参数和检测器。

在该软件中，按照文本方案所示显示相应的点图。使用仅含细胞的样本，获取部分细胞，并在白细胞群周围设置门控。根据白细胞门控，在SSC/CD45点图中对CD45