0 次观看 • 4:34 分钟 • July 8th, 2025
取一块多孔板，其中盖玻片上含有贴壁生长的骨肉瘤细胞。
这些骨癌细胞经诱导应激的化学物质预处理，从而形成应激颗粒。
应激颗粒是由非翻译状态的mRNA、小核糖体亚基、RNA结合蛋白（RBPs）、翻译相关因子以及信号蛋白组成的无膜细胞质结构。
弃去培养基，用缓冲液洗涤细胞。固定细胞以保持细胞形态。
对细胞进行透化处理，以接触细胞内靶标。加入封闭蛋白，防止抗体非特异性结合。
加入可结合应激颗粒内特定RNA结合蛋白（RBPs）及翻译相关因子的一抗。
使用不同的荧光染料标记的二抗以及Hoechst染料进行孵育。
二抗与结合在应激颗粒相关蛋白上的初级抗体结合，而 Hoechst 分子则对 DNA 进行染色。
使用封片剂将含有细胞的盖玻片进行封片。
使用荧光显微镜观察细胞，以观察和定量应激颗粒，这些颗粒表现为荧光焦点，其特征是相关蛋白的共定位。
为了固定细胞，先从孔中移除培养基，并用约 250 微升 PBS 清洗细胞。加入约 250 微升含缓冲液的 4% 多聚甲醛溶液以固定细胞，确保盖玻片上表面完全被覆盖。然后将培养板置于室温下的摇床上静置 15 分钟。接着，移除多聚甲醛并妥善处理废弃物。
加入约 250 微升预冷甲醇以透化并展平细胞。将培养板在室温下于摇床上继续孵育 5 分钟。透化完成后，弃去甲醇，并加入约 250 微升封闭缓冲液，在室温下封闭细胞 1 小时。随后，通过将 12 微升抗 G3BP1、eIF4G 和 eIF3b 抗体加入 3 毫升封闭缓冲液中，配制一抗溶液。
向24孔板的每孔中加入250微升抗体溶液。将板置于摇床上，室温孵育至少1小时。孵育1小时后，移除抗体溶液，并用约250微升PBS洗涤细胞5分钟。接着，将12微升抗小鼠Cy2、抗兔Cy3和抗山羊Cy5抗体与3微升Hoechst染料共同加入3毫升封闭缓冲液中，配制二抗溶液。
向每个孔中加入 250 微升二抗溶液，并用盖板覆盖以保护样品免受光照。在室温下将板置于摇床上孵育 1 小时。孵育结束后，移除抗体溶液，并用 PBS 洗涤细胞 5 分钟。将封片剂置于 37 摄氏度的加热块中加热 10 分钟以降低其黏度。然后，使用预先切好的 200 微升移液枪头，取 25 微升封片剂滴加到已标记的玻片上。
用精细镊子将盖玻片从孔中转移至载玻片上，翻转盖玻片使其细胞面朝向封片剂。用干净的 P200 枪头轻压盖玻片使其固定。待所有盖玻片封片完成后，用实验纸巾紧压载玻片以去除多余的封片剂。随后用水冲洗载玻片，并立即再次用实验纸巾吸干。