Name: 测量细菌感染小鼠和免疫反应李斯特菌 /em (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: 学习测量单核细胞增生李斯特菌感染小鼠的细菌负荷并制备肝脏和脾脏单细胞悬液的方法。该技术结合FACS分析，可用于评估不同小鼠品系的免疫应答差异，为研究胞内病原体与宿主相互作用提供重要实验手段。

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作者谨此感谢 Anna Walduck、Christina Cheers、Stuart Berzins、Dale Godfrey、Yifan Zhan 和 Jonathan Wilksch 提供的建议和试剂。本研究由青少年糖尿病研究基金会（1-2008-602）和澳大利亚国家卫生与医学研究委员会（575552）资助。NW 获得澳大利亚研究生奖学金的支持。OW 获得澳大利亚国家卫生与医学研究委员会 R.D. Wright 奖学金的支持。

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未声明任何利益冲突。

Listeria 是用于表征宿主对胞内细菌免疫应答的最常用生物体之一6。本文所述方案可实现对同一只小鼠特定组织中的细菌载量和免疫细胞应答进行测量。对每只感染小鼠的特定组织进行双重测量，可在小鼠群组内部及不同群组之间（代表不同小鼠品系或感染后不同时间点）提供更为可靠的比较。尽管通过口服途径感染 Listeria 也可用于研究小鼠的免疫应答，但通常采用静脉注射感染，原因如下：1）可确保细菌快速有效地进入血液循环；2）可产生同步且一致的全身性感染；3）Mus 属物种在编码 E-钙黏蛋白受体的基因上存在突变，该突变限制了 Listeria 通过口服途径的感染（此突变影响 Listeria 与小鼠 E-钙黏蛋白受体的结合能力，以及其有效穿越胃肠道上皮层的能力）16-18。
本实验方案中有几个关键步骤。首先，单核细胞增生李斯特菌（Listeria）接种物的储备液应由新鲜的HBA平板过夜培养物制备，以确保其活力和毒力。其次，在注射每只小鼠前后，必须准确测定接种物的CFU浓度，以确保第一只与最后一只注射小鼠之间的CFU浓度无显著差异。第三，向小鼠尾静脉注射Listeria的操作必须保持一致。最后，必须对肝脏进行灌注，以清除非驻留的白细胞，从而确保所检测的免疫细胞准确反映肝脏内的细胞组成，而非来自外周血中流经的白细胞。若上述任一步骤操作不当，均可能导致感染Listeria的小鼠之间在细菌载量和/或免疫应答方面出现不必要的个体间差异。
本方案的两个局限性在于研究者通过静脉注射感染小鼠的技术水平，以及组织中细菌载量的检测能力。如果由同一人注射大量小鼠，一旦冷冻接种物解冻后，Listeria 的存活率（即CFU浓度）可能会随时间下降（例如，第一只与最后一只小鼠注射之间间隔超过&gt;2小时）。接种物在活性受损前能够完成多少只小鼠的注射，需由研究者自行判断。该方法的另一个局限性是，由于培养的组织匀浆量相对较少，无法准确检测低于100 CFU/器官的Listeria载量（例如图3显示，100 CFU/器官为检测下限）。为了更准确地测定较低的CFU/器官数值，可增加组织匀浆的接种量（每平板最多0.5 mL，可使用多个平板），从而提高组织取样比例以检测Listeria。若无Stomacher仪器，可在步骤7.1–7.2中采用其他组织匀浆方法替代，例如使用组织匀浆器。在实际操作中，若37°C培养箱空间有限，无法容纳所有感染小鼠组织样本的培养，HBA培养平板可在室温下培养2–3天（但室温下菌落生长较慢）。然而，在制备冷冻Listeria菌种时，不应使用室温培养。
本方案为在小鼠中表征Listeria感染提供了基本方法，除EGD菌株外，也可用于其他Listeria菌株。除了肝脏和脾脏外，还可制备淋巴结的单细胞悬液。在这两种情况下，这些单细胞悬液均可用于多种分析，包括免疫细胞亚群的检测以及分选后免疫细胞的体外刺激。一旦掌握基本技术，本方案还可进一步改进，用于分离Listeria特异性T细胞19、表征树突状细胞20，或在感染后的特定时间点进行免疫细胞耗竭21,22，从而更全面地表征感染Listeria小鼠的免疫应答。

<table><tbody><tr><td>马血琼脂基础培养基第2号</td><td>Oxford Labware</td><td>CM0271</td><td>用于制备HBA平板的琼脂基础</td></tr><tr><td>脱纤维马血</td><td>Oxford Labware</td><td>HB1000</td><td>添加至琼脂基础中，终浓度为5-10%</td></tr><tr><td>脑心浸液（BHI）肉汤（10 mL）</td><td>Oxford Labware</td><td>TM456</td><td></td></tr><tr><td>脱水脑心浸液培养基</td><td>Oxford Labware</td><td>CM1135</td><td></td></tr><tr><td>96孔平底板</td><td>BD Biosciences</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 细胞滤器</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>小型培养皿</td><td>BD Biosciences</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Stomacher 80 biomaster 实验室系统</td><td>Seward</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塑料Stomacher均质袋</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>86 9924 530</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3912</td><td></td></tr><tr><td>FACS缓冲液</td><td></td><td></td><td>含0.1% (w/v) 牛血清白蛋白的PBS溶液</td></tr><tr><td>等渗Percoll（PBS中含33.75% Percoll）</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td>33.75 mL Percoll、3.75 mL 10x PBS、62.5 mL 1x PBS混合配制成100 mL等渗Percoll</td></tr><tr><td>TAC缓冲液</td><td></td><td></td><td>含17 mM Tris、140 mM氯化铵的去离子水溶液</td></tr><tr><td>FCS/EDTA缓冲液</td><td></td><td></td><td>含10 mM EDTA的胎牛血清</td></tr><tr><td>FACS/EDTA缓冲液</td><td></td><td></td><td>FACS缓冲液加5 mM EDTA</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td>0.4% (w/v) PBS溶液，过滤除菌</td></tr><tr><td>2 mL 冻存管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>121263</td><td></td></tr><tr><td>27号/1 mL 胰岛素注射器</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>SS10M2713</td><td></td></tr><tr><td>针头</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>NN-2516R (25G 5/8in) NN-2613R (26G 1/2in)</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>SS-01T (1mL), SS-053 (5mL), SS-10S (10mL)</td><td></td></tr></tbody></table>

测量感染小鼠中的细菌载量和免疫反应 单核细胞增生李斯特菌

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

单核细胞增生李斯特菌（Listeria） 是一种革兰氏阳性兼性胞内病原菌1小鼠研究通常采用静脉注射 单核细胞增生李斯特菌，导致全身性感染2注射后，由于CD8α细胞的摄取，李斯特菌迅速扩散至脾脏和肝脏。+ 树突状细胞和库普弗细胞3,4被吞噬后，多种细菌蛋白可促进 单核细胞增生李斯特菌 逃逸吞噬体，在胞质溶胶中存活，并感染邻近细胞5在感染的前三天，不同的天然免疫细胞（如单核细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞）介导杀菌机制，以最大限度地减少 单核细胞增生李斯特菌 增殖。CD8+ T细胞随后被招募，并负责最终清除 单核细胞增生李斯特菌 从宿主中，通常在感染后10天内6.
从感染的小鼠体内成功清除Listeria依赖于宿主免疫反应的适时启动6。不同近交系小鼠品系之间的敏感性存在广泛差异7,8。通常，对Listeria感染更易感的小鼠控制细菌增殖的能力较弱，与抗性小鼠相比，表现出更高的细菌载量和/或清除延迟。包括连锁分析和基因敲除小鼠品系在内的遗传学研究已鉴定出多个基因，其序列变异会影响宿主对Listeria感染的反应6,8-14。因此，测定并比较不同小鼠品系间的感染动力学是鉴定参与抗Listeria免疫反应的宿主遗传因素的重要方法。比较宿主对不同Listeria菌株的反应也是识别潜在细菌毒力因子的有效途径，这些因子可作为抗生素治疗或疫苗设计的潜在靶点。
本文介绍一种简便的方法，用于测定感染Listeria小鼠肝脏和脾脏组织中的细菌载量（每组织菌落形成单位 [CFU]），并制备肝脾单细胞悬液，以进行免疫应答的流式细胞术（FACS）分析。该方法特别适用于对新型小鼠品系中Listeria感染的初步表征，以及比较不同小鼠品系在感染Listeria后的免疫应答差异。我们使用的是Listeria monocytogenes EGD菌株15，该菌株在血琼脂平板上培养时，由于具有β-溶血活性1，每个菌落周围均呈现特征性的透明溶血环（图1）。通过下述方案，可在感染后的任意时间点，将组织匀浆接种于血琼脂平板培养以测定细菌载量，并同时制备组织单细胞悬液用于FACS分析。需要特别指出的是，免疫功能低下者或孕妇不应操作Listeria，实验开始前应咨询相关机构的生物安全委员会及动物设施管理部门。

Listeria monocytogenes 是研究小鼠对胞内细菌免疫反应和遗传易感性的模式生物。该方法可用于测定细菌载量，并制备小鼠肝脏和脾脏的单细胞悬液，以进行流式细胞术分析，从而确定李斯特菌（Listeria）感染引起的免疫细胞变化。

单核细胞增生李斯特菌（Listeria）是一种革兰氏阳性兼性胞内病原体1。小鼠实验通常采用静脉注射……

本视频演示了一种用于测定小鼠血液、肝脏和脾脏中的细菌载量，并制备及分析单细胞悬液的方法。首先，制备单核细胞增生李斯特菌（Listeria）接种物，并通过静脉注射接种至小鼠体内。随后，在选定的时间点处死小鼠，采集其血液、肝脏和脾脏组织。从收获的组织和组织匀浆中制备单细胞悬液，并将其接种于马血琼脂平板上进行培养。随后可通过流式细胞分析对所得的细胞悬液进行活力及免疫细胞成分分析，同时通过菌落形成单位测定细菌载量。该方法有助于表征对类固醇感染的免疫应答，例如在易感与耐药小鼠品系之间的免疫应答差异，同时可测定感染器官中的细菌载量。开始此操作前，先将单核增生李斯特菌（*Listeria*）接种物制备至所需浓度；有关李斯特菌的培养、保存和制备说明，请参见随附的书面实验方案。接种物准备好后，取两份各100微升（µL）样品，分别转移至含有900微升磷酸盐缓冲液（PBS）的无菌微量离心管中，制成1比10的稀释液；然后从每种稀释液中各取100微升，接种于马血琼脂（HBA）平板上，用无菌涂布棒充分涂布，用于菌落形成单位（CFU）计数；随后将平板倒置于37摄氏度（°C）培养过夜。接下来，将小鼠转移至清洁的笼子中。将笼子置于250瓦红外灯下50厘米处，持续5分钟，以确保尾静脉充分扩张。这有助于在注射过程中更清晰地观察静脉。此处涉及对李斯特菌抗性小鼠品系C57黑六以及李斯特菌易感小鼠品系进行注射。轻轻翻转试管数次，使李斯特菌悬液混匀后注射。然后用1毫升注射器配27号针头，每只小鼠注射200 µL。注射前务必排出注射器内的任何气泡。将小鼠放入固定装置中。然后通过首先识别位于背侧中央的尾动脉来定位小鼠的侧尾静脉。接着将尾巴轻轻转向外侧以识别静脉。用70%乙醇擦拭纸轻轻擦拭尾巴，然后在拔出注射器后进行注射。用无菌纱布方块轻轻按压穿刺伤口。注意注射后在黑色小鼠中更难识别尾静脉。注射完成后将小鼠放回笼中，并对剩余接种物进行培养以进行菌落形成单位计数。与前一天相同，计数菌落数量，并确定李斯特菌接种物注射前和注射后的浓度。此处所示单个菌落周围出现的特征性晕圈是由β-溶血所致。在确定注射前和注射后的菌落计数后，将注射前与注射后的菌落形成单位（CFU）计数相加，再除以2，计算出平均菌落形成单位。最后，在注射后的不同时间点，采集安乐死小鼠的血液，并收获其肝脏和脾脏。如果需要进行肝灌注分析，则必须在摘除肝脏前进行灌注，以便获取血液：在安乐死后立即进行心脏采血，并用适当的收集管尽可能多地收集血液。进行肝脏灌注时，首先打开腹腔，移除并丢弃胆囊。下腔静脉是一条与脊柱平行的静脉，负责将来自身体下部（包括肝脏）的血液输送至心脏。使用剪刀在心脏下方切断该静脉，以形成灌注液流出的出口。接着，将肝叶翻转向头部方向，并将肠道推向右侧，以暴露通向肝脏底部的门静脉。从右下侧插入一根弯曲的半英寸长、26号规格的针头至肝门静脉，并注入10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）。注入1至2毫升PBS后，肝脏颜色将由深红色变为浅棕色。注入的溶液会从切断的下腔静脉流出。肝脏灌注可确保所获取的细胞来源于肝脏本身，而非循环血液。接下来，将灌注后的肝脏从小鼠体腔中取出，并浸入置于冰上的 facts 缓冲液管中。然后取出脾脏，置于冰上，以备后续处理，处理方法将在下一节中详述。为了获得单个肝细胞悬液，首先将灌注后的肝脏从 fax 缓冲液转移至置于60毫米培养皿中的70微米细胞筛中。使用5升注射器活塞将组织推过细胞筛，进入培养皿中。将单细胞悬液转移至50毫升带螺口盖的锥形管中，并用冷FACS缓冲液定容至总体积40毫升。涡旋混匀细胞悬液。然后取1 mL等分试样用于细菌载量测定。在后续步骤中，将50 mL离心管放入离心机，在4 °C条件下以500 ×g离心5分钟，使细胞沉淀。弃去上清液后，用40毫升预冷的fax缓冲液重悬沉淀，再次进行洗涤步骤，并离心。重复重悬操作，将沉淀物在室温下用20毫升等渗缓冲液重悬，每孔加入，然后在室温下以700 × g离心12分钟。离心后，肝细胞会形成类似圆盘状的层漂浮在 Percoll 液上方，而白细胞则会沉淀在管底。将肝细胞层和 Percoll 液倒入废液容器中弃去。随后，将含有白细胞的沉淀物重新悬浮于 4 mL TAC 缓冲液中以裂解红细胞，并在室温下孵育最多 10 分钟，期间频繁颠倒混匀。孵育结束后，将细胞悬液通过 100 微米尼龙膜过滤至一个新的 10 mL 离心管中。如图所示，在过滤后的细胞悬液下方铺加1 mL Fax EDTA缓冲液。然后在4°C条件下以350 × g离心5分钟。离心后，用5 mL Fax EDTA缓冲液重悬沉淀，再次离心，并根据沉淀的大小，将沉淀重悬于0.5至3 mL Fax EDTA缓冲液中。使用血细胞计数板，基于台盼蓝排染法测定活肝源性白细胞的数量。随后可使用针对所需细胞表面标志物的特异性抗体对单细胞悬液进行标记，并通过流式细胞术进行分析。一旦从肝脏和脾脏组织中制备得到单细胞悬液，将对部分操作步骤测定细菌载量。将使用匀浆机对组织进行匀浆处理，同时夹闭装有组织的胃ER袋以防止泄漏。首先将组织平放在洁净的实验台上。用一支粗的圆珠笔在组织上滚动，直至组织在袋内被压碎。向每个含有压碎组织的胃组织袋中加入 5 mL PBS。将胃组织或袋子放入匀浆器中，以高速运行10分钟。该匀浆器配备两个桨叶，以设定速度按压胃组织或袋子，将内容物混合成均匀的匀浆，并使用移液器混匀袋中的匀浆，同时防止气溶胶扩散。然后将300微升匀浆液平行转移至96孔平底板中。在96孔板的各孔中进行1至10的连续稀释，直至稀释至10的5次方。对于每份组织匀浆样品，小心使用无菌涂布棒将每个稀释度的0.1毫升均匀涂布于预先干燥的HBA平板上。将平板在37°C条件下培养过夜。第二天，对每个稀释度的菌落形成单位数量进行计数，并根据组织稀释倍数及匀浆体积，计算每份组织的菌落形成单位数。观察C57BL/6小鼠在感染单核细胞增生李斯特菌约2000个菌落形成单位后第3天和第7天的情况，处死小鼠，灌注肝脏，并连同脾脏一并取出。将脾脏匀浆或肝脏单细胞悬液进行系列稀释，接种于HBA平板培养基上，以测定细菌载量。在本实验结果中，虚线表示每个器官每100个菌落形成单位的检测限。请注意，第三天的单核细胞增生李斯特菌（Listeria）载量高于第七天，这是因为到第七天时，多种免疫细胞已介导了李斯特菌的清除。在这两种组织——脾脏和肝脏中，单细胞悬液用台盼蓝染色后上样至血细胞计数仪。计数区域（红框内所示）中的细胞将被计数。死细胞会摄取台盼蓝而呈现蓝色，而活细胞则不着色。如图左侧所示，感染过程中脾脏内活细胞数量以及右侧肝脏内活白细胞数量均有所增加。这种增加是由于包括中性粒细胞和淋巴细胞在内的免疫细胞被激活、增殖并迁移至这两个感染部位所致。以单核细胞增生性李斯特菌感染过程中免疫细胞水平的变化为例，此处展示了具有代表性的流式细胞分析图谱以及CD8阳性T细胞的数量。CD8阳性T细胞的数量在感染后第2至3天由于脾脏中的淋巴细胞减少症而暂时性下降，随后从第5天起在脾脏和肝脏中均明显增加。在完成本操作后，还可进行其他方法，如雄激素振荡检测、抗原特异性T细胞分析以及分选免疫细胞的功能测定，以进一步表征对单核细胞增生性李斯特菌感染的免疫应答。

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测量细菌感染小鼠和免疫反应李斯特菌</em

来源：Lo, B. C., 等。慢性沙门氏菌感染诱导的肠道纤维化。J. Vis. Exp. (2019)该视频展示了在链霉素耐药细菌慢性感染的小鼠模型中，细菌载量的定量方法 沙门氏菌 typhimurium...

小鼠慢性肠道感染模型中组织细菌载量的定量分析

来源： McMullen, P. D., Freitag, N. E. 利用培养的心脏细胞评估细菌侵袭及感染小鼠心脏定植 单核细胞增生李斯特菌. 视频实验杂志 (2015)本视频演示了将单核细胞增生李斯特菌（Listeria...

通过尾静脉注射后定量小鼠心脏中的细菌载量 单核细胞增生李斯特菌

来源：Ahn, J. J., et al．利用单核细胞增生李斯特菌感染作为研究宿主干扰素-γ应答的模型．J. Vis. Exp.

系统感染后小鼠脾脏和肝脏中细菌载量的定量

来源：Ahn, J. J., 等 ，利用Listeria monocytogenes实验性感染作为研究宿主干扰素-γ应答的模型。J. Vis. Exp. (2016)本视频演示了从感染单核细胞增生李斯特菌（Listeria...

小鼠脾细胞体外热灭活刺激 单核细胞增生李斯特菌

本视频展示了从感染并经灌流的小鼠脑组织中定量可培养细菌载量的方法 单核细胞增生李斯特菌.

评估小鼠大脑中细菌定植情况 单核细胞增生李斯特菌 感染

本文介绍了一种利用单核细胞增生李斯特菌（Listeria...

通过摄入污染食物在小鼠中经口传播Listeria monocytogenes

单核细胞增生李斯特菌 可导致孕妇胎儿感染以及易感人群的脑膜炎。某些细菌亚群可定植于心脏组织，引起患者及实验动物的心肌炎。本文介绍了一种用于评估的实验方案 单核细胞增生李斯特菌 心肌细胞侵袭 体外 感染动物心脏定植情况。...

评估细菌在培养的心脏细胞中的侵袭能力及感染小鼠心脏定植情况的方法 单核细胞增生李斯特菌

本方案描述了如何用单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，L. monocytogenes）EGD 菌株感染 C57BL/6J 小鼠，以及在感染后通过自然杀伤（NK）细胞、自然杀伤 T（NKT）细胞和适应性 T...

Listeria monocytogenes 实验感染作为研究宿主干扰素-γ反应的模型

Listeria monocytogenes 对大脑的感染

我们描述了可用于分析宿主编码因子活性的体外和体内感染实验方法。...

利用细菌病原体探究宿主在细胞和有机体水平的应答

本文介绍了一种简洁的实验方案 体内...

小鼠中宿主-病原体反应及疫苗效力的评估

学习测量单核细胞增生李斯特菌感染小鼠的细菌负荷并制备肝脏和脾脏单细胞悬液的方法。该技术结合FACS分析，可用于评估不同小鼠品系的免疫应答差异，为研究胞内病原体与宿主相互作用提供重要实验手段。

测量感染小鼠中的细菌载量和免疫反应单核细胞增生李斯特菌

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测量感染小鼠中的细菌载量和免疫反应 单核细胞增生李斯特菌

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