一种评估粒细胞和单核细胞吞噬作用与氧化爆发活性的检测方法

从含有全血的试管开始，全血包括红细胞（RBCs）、白细胞（WBCs）（如单核细胞和粒细胞）以及其他血细胞。

将二氢乙啶（一种超氧阴离子指示剂）和未标记的细菌加入一个试管中，另一试管则加入绿色荧光标记的细菌进行处理。

粒细胞和单核细胞与细菌的病原体相关分子相互作用，并将它们吞噬到吞噬体中。

这会激活吞噬体膜上的酶  NADPH氧化酶，将分子氧还原为超氧阴离子。

超氧阴离子进一步生成过氧化氢——一种活性氧（ROS），从而导致氧化爆发。

在吞噬体内，活性氧（ROS）将二氢乙啶氧化生成2-羟基乙啶，后者可染色细菌DNA，产生红色荧光。

加入淬灭剂 ，以淬灭细胞外荧光。

加入裂解液，消除潜在的红细胞干扰，并固定白细胞。

在流式细胞术中，呈现绿色荧光的细胞证实了粒细胞和单核细胞的吞噬活性，而在另一管中呈现红色荧光的细胞则表明这些细胞存在氧爆发活性。

开始操作前，根据制造商说明书，使用血液分析仪对血液样本进行全血细胞计数及白细胞分类分析。记录各样本的白细胞计数（单位：个/毫升）以及中性粒细胞和单核细胞的百分比数值。

然后，针对每个实验管和对照管，使用加长型移液器吸头，将100 µL全血样本从含锂肝素的采血管转移至相应标记的12 mm × 75 mm试管底部。完成全部血液转移后，向用红色墨水标记并标有H的试管（包括HE对照管）中加入10 µL HE工作液，并盖紧试管。

将样品短暂涡旋混匀，然后将离心管转移至装有37摄氏度水浴的开放式金属架中，每5分钟轻轻振荡一次。15分钟后，迅速将金属架和离心管转移至冰水浴中，继续每5分钟轻轻振荡一次，持续12分钟。

孵育结束时，加入适当体积的未标记 S aureus 将工作液加入用红墨水标记并带有“H”的离心管中，包括HE对照管。盖紧管盖后短暂涡旋振荡。然后，加入适当体积的FITC标记的 S aureus 将工作液加入用黑色墨水标记并带有 F 的离心管中，包括 FITC 对照管，短暂涡旋混匀样品。

接下来，将所有试管置于37摄氏度水浴中孵育20分钟，每5分钟振荡一次，随后在冰水浴中冷却1分钟。将样品置于室温后，使用多通道移液器向所有试管中加入100 µL预冷的淬灭溶液，并涡旋混匀样品。

将样品放回冰浴中。一分钟后，使用重复移液器向每个试管中加入一毫升预冷的 PBS。然后涡旋振荡试管，并向样品中再加入两毫升 PBS。

现在，离心细胞并吸除上清液。使用多通道移液器，向各管中加入 50 µL 冰冷的 FBS。涡旋混匀后，将所有管子转移至转盘上。使用自动细胞裂解制备工作站，按照制造商说明书裂解红细胞，并固定白细胞。