利用功能化纳米抗体监测GFP标记的膜蛋白到达反式高尔基体网络的过程

从表达GFP标记表面蛋白且缺乏硫酸盐的癌细胞开始。

加入放射性标记的硫酸盐和修饰后的抗GFP纳米抗体——一种携带酪氨酸硫酸化基序的单链抗体，并进行孵育。

缺乏硫酸盐的细胞会内化放射性标记的硫酸盐，并将其掺入细胞组分中。

抗GFP纳米抗体与GFP标记的表面蛋白结合，并被内吞进入囊泡。该囊泡沿特定的细胞内途径运输纳米抗体-表面蛋白复合物，包括反式高尔基体网络（trans-Golgi network，TGN）。

在反式高尔基网络（TGN）中，磺基转移酶在底物存在的情况下，将放射性硫酸基团转移至纳米抗体的特定酪氨酸残基上，从而实现对其的放射性标记。

洗涤细胞。接着，裂解细胞。

离心裂解液以去除大的细胞碎片。使用镍珠纯化法分离纳米抗体。

将分离得到的组分上样至SDS-PAGE凝胶，以使放射性标记的纳米抗体分离成不同的条带。

将凝胶进行放射自显影。

最终的放射自显影图像显示出变暗的区域，表明存在放射性标记的纳米抗体。

在细胞培养超净台中，将400,000至500,000个稳定表达GFP标记报告蛋白的HeLa细胞接种于35 mm培养皿或6孔板中，加入含抗生素的完全培养基。于37°C、7.5%二氧化碳条件下培养过夜。次日，移除完全培养基，于室温下用1×PBS洗涤细胞两次。随后在37°C、7.5%二氧化碳条件下，用无硫酸盐培养基饥饿细胞1小时。

同时，在指定用于放射性工作的通风橱或工作台中，配制含有每毫升0.5毫居里硫-35标记的硫酸钠（sodium sulfate S35）的无硫酸盐培养基。接着，将VHH double-tier-sulf与1×PBS混合后加入上述标记培养基中，使其终浓度为每毫升2微克。当孵育完成后，弃去无硫酸盐培养基，加入0.7毫升已配制好的含硫-35标记硫酸钠和VHH double-tier-sulf的培养基混合液。将细胞置于专用于放射性工作的、含7.5%二氧化碳的培养箱中，在37摄氏度下孵育1小时。

此后，弃去标记培养基，用预冷的1× PBS在冰上或冷却板上洗涤细胞两到三次。加入1毫升裂解缓冲液，其中添加2毫摩尔PMSF和1×蛋白酶抑制剂混合物。将细胞在4摄氏度下于摇床上孵育10至15分钟。然后刮取细胞并转移裂解物至新的1.5毫升离心管中，涡旋混匀裂解物，再将其置于4摄氏度下翻转仪上孵育10至15分钟。在4摄氏度下以10,000 g离心10分钟，制备核后裂解物。将核后裂解物转移至含有预先制备的镍珠的1.5毫升离心管中，在4摄氏度下置于翻转摇床上孵育1小时，以分离纳米抗体。

此后，用1× PBS或裂解缓冲液轻柔地在1000 g 条件下离心1分钟，洗涤磁珠3次。小心移除磁珠中的全部洗涤缓冲液，加入50微升2×上样缓冲液。在95摄氏度下煮沸5分钟。然后将煮沸后的磁珠样品上样至一块中型12.5% SDS-PAGE凝胶，按照标准PAGE方案电泳，直至指示染料迁移至分离胶底部。将分离胶置于约30毫升固定液中，室温固定1小时。用约50毫升去离子水洗涤凝胶3次，然后按照文本方案中的说明干燥凝胶。干燥完成后，使用磷屏成像仪对凝胶进行放射自显影成像。