一种定量检测抗体介导的吞噬寄生虫感染红细胞的实验方法

取恶性疟原虫感染的红细胞。用荧光染料标记寄生虫DNA，以实现寄生虫的可视化。

将这些被寄生虫感染的红细胞与疟疾暴露个体的血清共同孵育。这些细胞表面会呈现寄生虫抗原，可与血清中天然获得的人源IgG抗体结合，从而使细胞被抗体包被，促进吞噬作用。

将调理过的寄生虫感染红细胞转移至含有悬浮人源单核细胞——或吞噬细胞——的蛋白包被多孔板中。

孵育过程中，单核细胞上的 Fc-γ 受体与 IgG 调理的红细胞相互作用，触发红细胞被吞噬进入吞噬体。

孵育结束后，离心微孔板以防止细胞间进一步相互作用并终止吞噬作用。

弃去上清液。加入氯化铵裂解液处理，选择性裂解未被吞噬的感染红细胞，而不影响单核细胞。

加入含血清的缓冲液以终止裂解过程。离心后弃去含有裂解红细胞的上清液。

用缓冲液重悬单核细胞。

通过流式细胞术定量检测单核细胞内含有寄生虫感染红细胞荧光的细胞，以确认其抗体介导的吞噬作用。

用含有溴化乙锭（终浓度为 2.5 微克/毫升）的寄生虫培养基将纯化的感染红细胞悬液调整至每毫升 3.3 × 10⁷ 个细胞。接下来，通过轻弹将一个 96 孔板中的封闭液甩入废液容器中。然后，在纸巾上除去残留液体，并向该板上半部分除一个孔以外的所有孔中加入 30 微升溴化乙锭标记的感染红细胞悬液。向空孔中加入 30 微升寄生虫培养基，并将该板在室温下避光孵育 10 分钟。

孵育结束后，向每孔加入 170 微升寄生虫培养基，并通过离心将感染的红细胞沉淀至板底。轻弹酶标板至废液容器中以去除上清液，再用 200 微升寄生虫培养基每孔洗涤溴化乙锭标记的感染红细胞两次，操作方法如前所述。

第二次洗涤后，使用多通道移液器小心移除每个孔中的全部上清液，避免扰动沉淀物，并将溴化乙锭标记的感染红细胞重悬于30 µL抗体溶液中，包括先前在寄生虫培养基中准备好的相应对照和待测样本。然后，将板置于37°C避光环境中孵育45分钟。

在对感染的红细胞进行调理的同时，通过离心收集 THP-1 细胞，并将沉淀重悬于 12 毫升新鲜预热的 THP-1 细胞培养基中。

第二次离心后，将沉淀重悬于1毫升THP-1细胞培养基中用于细胞计数，并用THP-1细胞培养基将细胞浓度调整至每毫升5 × 10⁵个细胞。移除第二个96孔板中的封闭液，每孔加入100 µL THP-1细胞，然后将该板放入细胞培养孵箱中。

在调理孵育结束时，向调理板的每个孔中加入170微升寄生虫培养基，并通过离心将感染的红细胞沉淀至板底。使用多通道移液器，每孔加入200微升寄生虫培养基，将已调理的感染红细胞洗涤两次；第二次洗涤后，小心移除上清液。

将调理过的感染红细胞用预热的THP-1细胞培养基重悬，每孔100微升，然后将每种调理过的感染红细胞悬液各50微升转移至吞噬作用检测板中对应的孔。所有细胞加完后，将板置于细胞培养箱中，避光孵育不超过40分钟。

孵育结束后，于4摄氏度离心以终止吞噬反应。移除上清液，每孔加入150微升室温的氯化铵裂解液重悬沉淀。精确孵育3分钟后，加入100微升冰上预冷的含2% FBS的PBS溶液以终止裂解，通过离心沉淀完整的细胞。

接下来，每次每孔加入 200 微升新鲜的预冷 PBS 缓冲液（含 2% FBS），洗涤细胞三次。最后一次洗涤后，每孔加入 200 微升新鲜的预冷 PBS 缓冲液（含 2% FBS），重悬细胞沉淀。

进行流式细胞术采集与分析时，立即将细胞上机至流式细胞仪，并利用未感染红细胞孔中的线性前向散射 versus 线性侧向散射图来圈选THP-1细胞。在此门内采集10,000个事件，并使用经阳性对照调理的感染红细胞与THP-1细胞共孵育的样本，设置直方图以检测溴化乙锭荧光强度。

进行分析时，打开未感染红细胞孔的线性前向散射 versus 线性侧向散射图，圈选THP-1细胞。然后，在FL3直方图中设置阳性门控，并将这些门控复制到所有其他样本孔中，以确定溴化乙锭阳性THP-1细胞的百分比。