一种利用荧光报告分子体外检测中性粒细胞丝氨酸蛋白酶活性的实验方法

取一个含有中性粒细胞丝氨酸蛋白酶（neutrophil serine proteases，NSPs）的微孔板。这些由中性粒细胞分泌的可溶性酶具有蛋白水解活性，在炎症反应中发挥作用。

加入携带识别序列的荧光报告探针，该识别序列可作为非结构蛋白酶（NSPs）的切割位点。这些探针偶联有供体和受体荧光基团。

当受到特定波长的激发时，供体荧光基团会发射能量。由于与供体位置相近，受体荧光基团吸收该能量，并发射出不同波长的荧光。

分别检测供体和受体信号，并计算供体与受体的比值以评估 NSP 活性。较低的比值表明在探针未发生切割的情况下供体荧光被淬灭。

NSPs 识别并切割探针上的识别序列，释放受体。

当供体荧光团与受体之间的距离增加时，供体的荧光发射得以恢复，从而提高供体与受体的荧光强度比值。该比值越高，表明NSPs对探针的切割效率越高。

将酶在冰上解冻，并按照文稿中所述方法建立酶的标准曲线。在制备标准品的同时，用激活缓冲液稀释痰液样本。在酶标仪上，将NE FRET探针NEmo-1的激发波长设置为354纳米，供体发射波长设置为400纳米，受体发射波长设置为490纳米。

对于CG FRET探针sSAM，将激发波长设置为405纳米，供体发射波长设置为485纳米，受体发射波长设置为580纳米。向黑色96孔半面积板的孔中加入40微升样品、标准品或空白溶液，然后加入预混液。

启动酶标仪，每隔 60 至 90 秒记录一次供体与受体荧光强度比值的增加情况，持续至少 20 分钟，或直至信号增长达到平台期。导出数据后，通过将每个时间点和样品的供体 RFU 除以受体 RFU，计算供体与受体比值。然后计算供体与受体比值的平均值和标准偏差。确定供体与受体比值变化在线性增长阶段的斜率。