一种用于研究预先活化的CD8⁺ T细胞对癌细胞毒性的体外实验方法

取两个CD8⁺ T细胞群：效应CD8⁺ 通过抗体介导的T细胞受体及共刺激受体激活并抑制CD8的T细胞预激活⁺ 髓源性抑制细胞抑制T细胞。

将这些T细胞加入已包被基底膜且含有表达核限制性荧光蛋白的癌细胞的孔中。

用移液器吸取一种荧光原性caspase-3底物——一种与含有caspase-3识别位点的肽段偶联的DNA结合型荧光原性染料。

孵育。效应T细胞受体与癌细胞上的I类MHC-肽复合物结合，触发含有穿孔素和颗粒酶的细胞毒性颗粒释放。

穿孔素在癌细胞膜上形成孔道，使颗粒酶进入并激活caspase，从而启动细胞凋亡。

活化的半胱天冬酶还会切割荧光 caspase 底物，释放出可与 DNA 结合并产生荧光的染料。

在荧光显微镜下，与效应T细胞共培养的癌细胞表现出双重核荧光，表明癌细胞发生凋亡。

相比之下，与受抑制的T细胞共培养的癌细胞仅显示细胞核蛋白荧光，提示为非凋亡细胞。

为建立预先活化的CD8阳性T细胞与靶细胞的共培养体系，首先将30微升1:100稀释的、不含生长因子的可溶性基底膜基质加入适合显微镜观察的96孔平底板的相应孔中。轻轻振荡培养板使基质均匀分布，并将培养板置于细胞培养箱中孵育至少1小时。在培养板平衡期间，开始准备靶细胞。吸除培养基，用PBS洗涤，并在室温下加入1毫升0.05%的胰蛋白酶-EDTA溶液，孵育1分钟。

通过轻柔吹打加入9毫升添加了胎牛血清的DMEM，并将解离的细胞转移至离心管中。离心后，将细胞沉淀重悬于500微升EDMEM中。将重悬的细胞经细胞滤网过滤，计数活细胞。然后，在冰上用新鲜EDMEM将细胞密度调整至每毫升4×10⁴个目标细胞。

接下来，用移液器轻轻吹打预活化的 CD8 阳性 T 细胞数次，使细胞重悬并形成单细胞悬液，并将悬浮的 T 细胞转移至每种条件下对应的 1.5 毫升离心管中。用每孔 200 微升 PBS 收集残留细胞，将洗涤液转移至相应的 1.5 毫升离心管中，然后离心。吸除上清液，并向每根离心管中加入 1 毫升 EDMEM 进行离心。

离心后，每管用100 µL新鲜EDMEM重悬沉淀。计数后，将每管细胞调整至每毫升培养基含1.6 × 10⁵个预活化的CD8阳性T细胞的密度，并将细胞置于冰上。当细胞准备就绪后，从96孔显微镜培养板的每个孔中吸除基底膜基质，然后在板内侧60个孔中分别加入50 µL靶细胞，加样时需混匀。

向适当的孔中加入25微升EDMEM，其中添加含4×10³单位/毫升的IL-2以及10微摩尔荧光素标记的caspase-3底物。然后，向相应的孔中加入25微升预先活化的CD8阳性T细胞，最后向适当的孔中加入EDMEM，使总体积达到100微升。向所有空孔中加入200微升PBS或无菌水，震荡培养板，并将其置于水平面上静置10分钟。

为成像细胞，需将显微镜设置为采集相位差图像，以及适用于细胞核限制性荧光蛋白和实验中所用的荧光激活型活化半胱天冬酶-3底物荧光染料的荧光通道图像。随后，每隔一至三小时对每个实验孔采集相位差图像及两个荧光通道的图像，持续至少72小时。