巨噬细胞中多种Caspase激活的评估

从含有贴壁的骨髓来源巨噬细胞的多孔板开始。

引入与巨噬细胞融合的甲型流感病毒，释放含有病毒RNA的核糖核蛋白。

巨噬细胞的Z型DNA结合蛋白1（ZBP1）与病毒核糖核蛋白相互作用，触发ZBP1的寡聚化，并招募激酶和caspase 8。

寡聚化的ZBP1进一步招募炎性小体感受器蛋白、衔接蛋白和前体caspase-1，形成一种多聚复合物——PANoptosome。

在PANoptosome内，起始型caspase-8通过邻近切割而激活，进而激活效应caspase，包括caspase-3和caspase-7。

此外，PANoptosome 内的炎性小体感受器蛋白可激活信号级联反应，将前体半胱天冬酶-1（pro-caspase-1）转化为其活性形式半胱天冬酶-1（caspase-1）。

同时，病毒感染会诱导细胞色素-c从线粒体释放，从而触发凋亡体的活化，并将前体半胱天冬酶-9转化为其活性形式。

病毒感染还会触发非经典炎性小体通路，激活caspase-11。

加入裂解缓冲液以裂解巨噬细胞；收集裂解物，并加热以灭活蛋白酶，防止半胱天冬酶（caspases）降解。

离心并收集含有多种半胱天冬酶的上清液，用于进一步分析。

分离骨髓并诱导BMDM分化后，用甲型流感病毒感染细胞。根据20个空斑形成单位的感染复数计算所需的病毒体积。移除BMDM的培养基，用500微升PBS洗涤细胞一次。在每个孔中加入450微升不含热灭活FBS的高糖DMEM配制的甲型流感病毒，于37摄氏度湿润培养箱中孵育1小时，以使病毒吸附。

在1小时孵育结束后，加入50微升热灭活的FBS，并将培养板放回37摄氏度培养箱中继续孵育，总孵育时间达到12小时。12小时孵育后，从培养箱中取出培养板。吸取150微升上清液，弃去或保存用于上清液分析。不要移除剩余的上清液。

现在，通过将每孔50微升的caspase裂解缓冲液与100微升4X SDS缓冲液混合，制备蛋白收集液。然后，向每孔加入150微升该混合液。

对于每个孔，用移液器吹打混合液以收集裂解的细胞和上清液。移液时，用移液器吸头刮擦孔底，以充分裂解细胞。刮擦并移液后，将蛋白裂解液收集至预先标记的1.5毫升离心管中。使用加热金属块将所有离心管在100摄氏度下加热12分钟。从加热金属块中取出离心管，于室温下以14,500 g 离心30秒，使不溶性组分沉淀。