一种基于多重微球的检测方法用于分析人泪液样本中的细胞因子

将人泪液样本和抗体-磁珠混合液加入已洗涤的检测板中。

抗体结合在颜色编码的磁珠上，磁珠中浸渍了不同比例的荧光染料，对应不同的光谱特征，从而实现多种细胞因子的检测。

泪液中的细胞因子与相应珠结合的捕获抗体结合。

使用磁力板洗涤仪沉淀抗体-磁珠复合物。用缓冲液去除未结合的生物分子。

加入与已结合的细胞因子结合的生物素化检测抗体。

加入链霉亲和素-藻红蛋白偶联物，该偶联物可结合生物素化的抗体。

使用洗板机去除未结合的孔内物质。用鞘液重悬细胞因子结合的复合物。

在样品分析过程中，流体系统将珠复合物运送至光学组件。

第一束激光激活内部微珠染料，产生的信号用于识别特定的细胞因子。

第二束激光激活与微球复合物结合的报告分子，其信号强度代表细胞因子的浓度，从而实现对多种细胞因子的同步定量。

进行基于微球的多重检测时，将所有试剂恢复至室温，并涡旋震荡5到10秒。若洗脱的泪液样本在检测前保存于负80摄氏度条件下，请将冻存的泪液提取物置于冰上解冻，并在1,000 × g 条件下离心5分钟。为人类细胞因子标准品QC-1、QC-2及样本准备一份垂直排列的检测工作表。

向板的每个孔中加入 200 微升 1 倍洗涤缓冲液，并用板封膜密封。然后在室温下将板置于板式摇床上孵育 10 分钟。接着通过倒置板弃去 1 倍洗涤缓冲液，并将板在吸水纸上轻拍数次，以去除孔中残留的洗涤缓冲液。

然后，向相应的孔中分别加入25 µL的每种工作浓度人细胞因子标准品QC-1、QC-2，以及仅含检测缓冲液的空白孔和样品。每孔加入25 µL检测缓冲液。然后，向各孔中加入25 µL 1x抗体-磁珠混合溶液。

由于抗体磁珠溶液对光敏感，需密封反应板，并用铝箔和板盖包裹，以在实验过程中避光。将反应板置于4°C摇床中过夜孵育。次日，将反应板放置于自动磁力板洗涤仪的板架上，静置一分钟，使磁珠沉降至孔底。

使用自动磁性板洗涤仪吸出孔内液体，每孔加入 200 微升洗涤缓冲液。静置 1 分钟后，再次吸出孔内液体，并重复洗涤一次。每孔加入 25 微升检测抗体溶液。密封酶标板，用铝箔纸和板盖覆盖，于摇床上室温孵育 60 分钟。然后，每孔加入 25 微升链霉亲和素-藻红蛋白溶液，密封并覆盖酶标板后，于摇床上室温孵育 30 分钟。

孵育结束后，将酶标板置于磁性板洗涤器上，静置1分钟。随后吸去孔内液体，每孔加入200 µL洗涤缓冲液。静置1分钟后，吸去孔内液体，再重复洗涤一次。每孔加入150 µL鞘液。然后将酶标板置于摇床上，室温振荡5分钟，以重悬抗体磁珠，随后进行酶标板读数并分析细胞因子浓度。