一种微量中和测定法，用于测量人血清中和抗体滴度

对于微量中和测定，取一个多孔板，里面装有热灭活的连续稀释的人血清，流感特异性中和抗体的浓度降低。

引入致病性流感病毒。血清抗体与病毒相互作用并中和病毒;然而，较高的血清稀释度表现出有限的病毒中和作用。

子含有 Madine-Darby 犬肾细胞或 MDCK 细胞，在其表面过表达人唾液酸残基。

在较高的稀释度下，未中和的流感病毒与细胞的唾液酸融合，将病毒基因组释放到细胞质中。

病毒基因在宿主细胞内被转录并翻译成病毒蛋白和核蛋白。

用高浓度丙酮处理以进行固定和透化。

引入与病毒核蛋白相互作用的一抗。

与与一抗相互作用的酶偶联二抗叠加。用酶的底物清洗和处理，产生有色产品。

量化颜色强度并将其与血清稀释度进行对比;达到 50% 病毒中和率的最高血清稀释度代表中和滴度。

在MN测定的第1天，在37摄氏度的水浴中解冻血清，解冻后立即取出。如文本方案所述，在56摄氏度的水浴中热灭活人血清30分钟。然后，将血清放在冰上，并将病毒稀释剂添加到血清中，以达到 1 到 10 的预稀释。

要使用一种病毒进行测试，请在 B 至 H 行（第 11 列和第 12 列除外）中添加 50 微升病毒稀释剂。然后，将 100 微升 10 种稀释血清中的 1 种加入 A1 至 A10 列中。从 A 行到 H 行进行两次连续稀释，并在 H 行丢弃最后 50 微升。

对于病毒对照，向孔 A12、B12、C12 和 D12 中加入 50 微升病毒稀释剂。对于细胞对照，向孔 E12、F12、G12 和 H12 中加入 100 微升病毒稀释剂。对于对照血清，向孔 A 的第 11 列中加入 100 微升稀释的对照血清，然后向孔 B11 至 H11 中加入 50 微升病毒稀释剂。继续连续稀释。盖上板并在 37 摄氏度、5% 二氧化碳下孵育，直到准备好添加病毒。

对于病毒添加，用病毒稀释剂将病毒稀释至 100 TCID50 在 50 微升中。向所有孔中加入 50 微升稀释病毒，反滴定板上的第 11 列以及所有板上的细胞对照孔 E12、F12、G12 和 H12 除外。向第 11 列中的所有孔中加入 50 微升病毒稀释剂。然后，在 50 微升中以 100 TCID50 的 50 微升病毒加入第一个孔中。

接下来，将 50 微升混合并转移到连续的孔中，以进行两次连续稀释。在孔之间更换移液器吸头以避免病毒携带。从 H11 孔中弃去 50 微升，然后向第 11 列中加入 50 微升病毒稀释剂，使最终体积达到 100 微升。轻敲盘子进行混合。将板在 37 摄氏度、5% 二氧化碳下孵育一小时，然后在第一天进行 MDCK 细胞添加，并在第二天像以前一样进行 ELISA。

添加一抗和二抗后，如文本方案中所述，进行底物添加和板读取。用 300 微升洗涤缓冲液清洗板五次，然后轻敲无绒湿巾。向每个孔中加入 100 微升新鲜制备的 OPD 底物。然后，在室温下孵育板，直到病毒对照孔在 0.8 到 3 之间达到 490 纳米的光密度，细胞对照在低背景 OD 小于 0.2 下。接下来，向所有孔中加入 100 微升终止溶液。

使用微孔板分光光度计读取490纳米处孔的OD。最后，确定每个血清样品的中和抗体滴度，如文本方案中所述。