0 次观看 • 5:33 分钟 • July 8th, 2025
进行微量中和试验时，取一块多孔板，其中含有经热灭活、连续稀释的人血清，血清中流感特异性中和抗体的浓度依次降低。
引入致病性流感病毒。血清抗体与病毒相互作用并中和病毒；然而，较高的血清稀释度表现出有限的病毒中和能力。
在表面过表达人源唾液酸残基的 Madine-Darby 犬肾细胞（MDCK 细胞）上接种。
在较高稀释度下，未被中和的流感病毒与细胞的唾液酸发生融合，将病毒基因组释放到细胞质中。
病毒基因在宿主细胞内被转录并翻译成病毒蛋白和核蛋白。
使用高浓度丙酮处理，以进行固定和通透。
加入与病毒核蛋白相互作用的一抗。
加入酶标记的二抗，与一抗结合。洗涤后加入酶的底物，产生显色反应产物。
定量分析颜色强度，并将其对血清稀释倍数作图；达到50%病毒中和效应的最高血清稀释倍数即为中和滴度。
在MN试验的第1天，将血清置于37摄氏度水浴中解冻，并在解冻后立即取出。按照文本方案所述，将人血清在56摄氏度水浴中热灭活30分钟。随后将血清置于冰上，并加入病毒稀释液，使血清预稀释至1:10。
若仅测试一种病毒，除第11和12列外，在B至H行中各加入50微升病毒稀释液。然后，在A1至A10列中各加入100微升1:10稀释的血清。从A行至H行进行两倍系列稀释，并弃去H行的最后50微升。
对于病毒对照，在 A12、B12、C12 和 D12 孔中各加入 50 µL 病毒稀释液。对于细胞对照，在 E12、F12、G12 和 H12 孔中各加入 100 µL 病毒稀释液。对于对照血清，在第 11 列 A 孔中加入 100 µL 稀释后的对照血清，并在 B11 至 H11 孔中各加入 50 µL 病毒稀释液。随后进行系列稀释。盖好培养板，于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育，直至准备加入病毒。
加入病毒时，用病毒稀释液将病毒稀释至每50微升含100 TCID50。除返滴定板的第11列以及所有板上的细胞对照孔E12、F12、G12和H12外，向其余各孔加入50微升稀释后的病毒。向所有板第11列的各孔中加入50微升病毒稀释液。然后，向第一孔加入50微升含100 TCID50的病毒溶液（溶于50微升稀释液中）。
接下来，混合后取 50 微升转移至后续孔中，进行两倍系列稀释。每次更换孔时需更换移液器吸头，以避免病毒残留。从 H11 孔中弃去 50 微升，然后向第 11 列加入 50 微升病毒稀释液，使最终体积达到 100 微升。轻敲酶标板以混匀。将酶标板置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育 1 小时，然后在第一天按前述方法加入 MDCK 细胞，在第二天进行 ELISA 检测。
按照文本方案中所述添加一抗和二抗后，进行底物添加和酶标板读数。用300微升洗涤缓冲液将酶标板洗涤5次，并在无绒布上轻拍去除残留液体。向每孔加入100微升新鲜配制的OPD底物溶液。然后将酶标板在室温下孵育，直至病毒对照孔在490纳米处的光密度值达到0.8至3之间，同时细胞对照孔的背景OD值保持较低，低于0.2。接着，向所有孔中加入100微升终止液。
使用微孔板分光光度计在 490 纳米处读取各孔的 OD 值。最后，按照文本方案中所述方法确定每份血清样本的中和抗体滴度。