一种检测免疫诱导时拟南芥叶盘氧化爆发的测定法

0 views • 2:58 min • July 8th, 2025

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获得拟南芥叶盘。将它们浸入含有双蒸水的微孔板孔中,以防止干燥。

育椎间盘以允许从伤口中恢复。

孵育后,除去水。加入含有源自细菌的肽、辣根过氧化物酶和鲁米诺的反应混合物。

使用酶标仪测量随时间变化的发光。

植物细胞上的模式识别受体或PRR结合细菌肽,细菌肽是微生物相关的分子模式。

此外,PRR 与其辅助受体结合,经历相互磷酸化,激活受体样蛋白激酶,并引起细胞内钙流入。

这反过来又激活跨膜呼吸爆发氧化酶同源物或 RBOH 蛋白。

活化的 RBOH 催化细胞外活性氧 (ROS) 的产生,引起氧化爆发。此外,ROS 被转化为过氧化氢

辣根过氧化物酶利用过氧化氢将鲁米诺氧化成激发态,返回基态后发出发光。

测量发光以监测微生物模式识别后的快速氧化爆发。

在发芽后 4 至 5 周,使用锋利的 4 毫米活检冲头去除每株拟南芥植物的一个叶盘,避开中脉并小心限制伤口。将圆盘收集到未使用的 96 孔光度计板的各个孔中,该板每孔含有 100 微升双蒸馏水,轴向向上,以防止干燥。

如果评估多个诱导子,请为每次诱导子处理从同一叶子上取出第二个叶盘,并用盖子盖住板,让叶盘在室温下恢复过夜。第二天早上,将酶标仪参数设置为 1,000 毫秒的积分时间,间隔为 2 分钟,间隔为 40 至 60 分钟,以捕获动态氧化爆发。

接下来,使用多通道移液器用 100 微升新鲜制备的反应溶液替换每个孔中的水,包括每种基因型的对照无诱导剂反应,以评估在没有诱导的情况下的基础反应氧水平。然后,立即在酶标仪上测量可见光谱中所有波长的发光

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Last updated: 4 July 2026