一种检测氧化爆发的实验方法 拟南芥 免疫诱导后的叶片圆片

获取拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶片圆片，将其浸入含有双蒸水的微孔板孔中，以防止干燥。

孵育圆盘，使样品从损伤中恢复。

孵育结束后，去除水分。加入含有细菌来源肽、辣根过氧化物酶和鲁米诺的反应混合物。

使用微孔板读板仪，随时间测量发光量。

植物细胞上的模式识别受体（PRRs）可结合细菌肽，这些细菌肽属于微生物相关分子模式。

此外，PRR与其共受体结合，发生相互磷酸化，激活类受体蛋白激酶，并引起细胞内钙离子内流。

这反过来会激活跨膜呼吸爆发氧化酶同源物（RBOH）蛋白。

活化的 RBOH 催化胞外活性氧（ROS）的生成，引发氧化爆发。此外，ROS 会转化为过氧化氢.

辣根过氧化物酶利用过氧化氢将鲁米诺氧化至激发态，后者在回到基态时发出化学发光。

通过检测发光来监测微生物模式识别后迅速发生的氧化爆发。

萌发后4至5周，使用锋利的4毫米活检打孔器，每株取一片叶圆片 拟南芥 植物，避开主脉，并注意尽量减少损伤。将圆片收集到未使用过的96孔化学发光仪板的各个孔中，每孔预先加入100微升双蒸水，确保圆片轴面向上，以防干燥。

若需评估多种激发子，对每种激发子处理均从同一叶片上再取一个叶盘，并用培养皿盖盖住，于室温下过夜恢复。次日早晨，设置酶标仪参数，在40至60分钟内每2分钟进行一次检测，每次积分时间为1,000毫秒，以捕捉动态的氧化爆发过程。

接下来，使用多通道移液器将每个孔中的水替换为100 µL新配制的反应溶液，每种基因型均需设置无诱导剂的对照反应，以评估在无诱导条件下基础的活性氧水平。然后，立即在微孔板读板仪上测定可见光谱范围内所有波长的发光信号。