一种检测水稻组织免疫诱导后活性氧产生的测定方法

取一个微孔板，其中含有从水稻幼苗上切取的均匀鞘段以及从水稻植株叶片上获取的叶圆片。

加入无菌水，过夜培养以使样品从伤口胁迫中恢复。

添加一种来源于细菌鞭毛的免疫原性肽，该肽作为一种病原体相关分子模式（PAMP）发挥作用。

植物细胞在切割边缘与PAMPs结合 通过 模式识别受体

这种结合会触发下游信号传导，激活一种定位于质膜上的酶，称为呼吸爆发氧化酶同源物（respiratory burst oxidase homolog）或 RBOH。

活化的RBOH在质外体（即细胞间隙）中产生活性氧（ROS）。所产生的活性氧会转化为过氧化氢。

加入过氧化物酶和化学发光底物。

过氧化物酶利用过氧化氢将底物转化为激发态中间产物，该中间产物以光的形式释放能量，并回到基态。

检测两种组织类型的发光情况，以观察PAMP处理后是否立即出现显著增强，这表明产生了ROS爆发。

在活性氧检测前一天，用锋利的剃须刀片或手术刀片将10日龄水稻幼苗的叶鞘切成3毫米长的片段进行预处理。将5个叶鞘片段放入96孔微孔板的单个孔中，每孔加入100 µL双蒸水，浸泡10至12小时。

使用带推杆的活体组织穿孔器从四到六周大的水稻植株上切取叶圆片。为减少数据变异，应始终从主茎第二片叶的中间三分之一区域切取叶圆片。接着，将一片叶圆片放入96孔微孔板的单个孔中，每孔加入100 µL双蒸水，预处理10至12小时。所有叶圆片应保持漂浮状态，并正面朝上置于微孔板的孔中进行水预处理，以避免因叶片朝向不同而引起的变异。

通过混合9.4 ml的50 µM Tris-HCl、400 µl的L-012溶液、100 µl辣根过氧化物酶和100 µl flg22来配制诱导溶液。向各孔中加入200 µl诱导溶液。

启动软件，点击 实验 按钮以创建新方案或使用现有方案。在弹出窗口中点击 步骤，设置微孔板并选择需要监测的孔位。点击 开始动力学，将运行时间设置为30分钟或更长，具体时长根据实验需求而定。选择最小时间间隔以尽可能频繁地获取读数，积分时间则根据信号强度选择1秒或更长时间。

单击验证，然后单击确定以确认设置。随后在弹出窗口中单击检测新板，并等待软件提示加载板对话框。小心地从含有预处理组织的孔中移除双蒸水，避免对组织造成损伤或干燥。使用多通道移液器向含有组织的孔中加入200 µL诱导溶液。将待测板放置在载板架上，开始检测。