在混合T细胞群体中测量异体反应性

从含有携带同种异体抗原或自身抗原遗传变异的鼠源树突状细胞（DCs）的多孔板开始。

引入小鼠T细胞，包括对自身抗原无反应性但能识别外来抗原的异源反应性T细胞。

同种反应性T细胞识别这些同种抗原并与树突状细胞相互作用，引发细胞骨架重排，包括F-actin的重组。

这会促进T细胞上的受体与树突状细胞（DCs）上的共刺激分子相互作用，形成细胞连接——即免疫突触。

固定细胞，将其转移至离心管中，并加入针对T细胞和树突状细胞受体的荧光染料标记抗体混合物，使其呈现不同的荧光信号。

去除未结合的抗体，并将细胞重悬于含有通透剂的缓冲液中，该缓冲液可使细胞通透，同时含有绿色荧光标记的蛋白探针，可结合F-肌动蛋白。

离心并用含有细胞核染料的缓冲液重悬细胞，使细胞核染成红色。

利用成像流式细胞术识别双联体——对应于具有F-肌动蛋白绿色十字准线的T细胞与树突状细胞的结合物，以确认免疫突触的形成。

量化代表同种异体反应程度的双峰。

首先将0.5 × 10⁶个树突状细胞接种至96孔细胞培养板的每孔中，随后加入1 × 10⁶个T细胞，每孔培养基总体积不超过50 µL。将培养物在37 °C、5% CO₂条件下孵育4小时。

然后，向每孔加入三倍培养液体积的含1.5%多聚甲醛的PBS溶液，室温孵育30分钟。固定结束后，将每孔中的细胞转移至相应的5毫升聚苯乙烯管中，并在100微升洗涤缓冲液中加入适量荧光染料标记的抗体，室温避光孵育30分钟。

随后，用1毫升洗涤缓冲液洗涤细胞，并将细胞沉淀重悬于含有鬼笔环肽-FITC的透化洗涤缓冲液中。室温避光孵育30分钟后，再用1毫升新鲜的透化洗涤缓冲液洗涤细胞。将细胞沉淀重悬于含感兴趣核染料的透化洗涤缓冲液中，室温避光进行最后30分钟的孵育，然后用1毫升透化洗涤缓冲液洗涤细胞，再用洗涤缓冲液单独洗涤一次。最后，将细胞重悬于50至100微升新鲜洗涤缓冲液中，并将细胞转移至带小盖的微量离心管中。

为了分析细胞间的相互作用，首先预留一个通道用于明场图像采集，并加载第一个对照管。关闭明场通道后，在工作区窗口中，为每个使用的通道创建一个新的散点图，以长宽比对面积作图，并圈选长宽比接近1的单细胞群体。

针对每种荧光染料，检查阳性细胞群，并根据需要在照明设置框中调整激光电压。在通道框中，选择与染色所用荧光染料相对应的适当通道。然后点击记录。当获取的事件数达到预设阈值时，采集将自动停止。

在获取所有单染对照样本后，加载第一个实验样本管，并在适当的分析通道（包括明场通道）下采集数万次事件。