通过流式细胞术鉴定和计数支气管肺泡灌洗液中的免疫细胞

从一个含有小鼠支气管肺泡灌洗液的多孔板开始，该灌洗液包含经绿色荧光活力染料染色的免疫细胞群体。

引入Fc抗体以阻断免疫细胞的Fc受体。

加入针对特定细胞标志物的、带有不同荧光染料标记的抗体混合物。去除未结合的抗体，并将细胞重悬于缓冲液中。

通过流式细胞术，识别微弱荧光的单细胞，以指示活细胞。

在488纳米波长下激发细胞，使细胞发出红色荧光，该荧光与表达CD11c的细胞相关。

在高表达CD11c的细胞群中，使用适当的波长滤光片，鉴定树突状细胞上的细胞标志物蛋白MHC-II和巨噬细胞上的SiglecF。

在CD11c低表达群体中，T细胞表面CD3和B细胞表面CD19的表达可用于鉴定这两类细胞。

在405纳米波长下激发细胞，发出蓝色荧光，表明为表达CD11b的中性粒细胞。

在 633 纳米波长下照射细胞可激发表达 Ly-6G 的嗜酸性粒细胞上的远红荧光染料。

利用流式细胞术数据，对支气管肺泡灌洗液中各类免疫细胞的丰度进行计数。

第三次支气管肺泡灌洗液收集完成后，将合并的灌洗液离心，并将上清液于负80摄氏度保存。将沉淀物重悬于200微升ACK裂解缓冲液中。室温下裂解不超过两分钟后，加入1毫升预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）稀释裂解液，随后通过离心收集细胞。

根据待分析样品的数量，用适当体积的PBS重悬沉淀，并将细胞分装至96孔板中相应数量的孔内进行分析。再次离心收集细胞，然后将沉淀重悬于50 µL含FC阻断剂的PBS中。

室温孵育10分钟后，向每孔加入50 µL相应的目标抗体混合液，在4°C避光孵育30分钟。孵育结束后，离心微孔板并弃去上清液，将沉淀重悬于每孔200 µL FACS缓冲液中，用于流式细胞术分析。