大鼠肠系膜血管生成实验

欢迎来到瑞典古滕堡盖恩大学医院病理科。我是克劳斯·诺比博士，您即将看到的方法由我的实验室开发。临床上相关的血管生成通常在缺氧、实体瘤或任何其他血管生成性疾病中发生，几乎 exclusively 发生在具有天然血管化的组织中。在成年小型啮齿类动物中，连接小肠与体腔后壁的肠系膜含有多个薄而膜状的区域。在大鼠中，这类肠系膜窗大约有 40 至 50 个。它们几乎透明，肉眼观察时形似窗口，每个窗口周围均被脂肪组织包围。

肠系膜窗原本具有血管化特征，且无明显的生理性血管生成。因此，它们为研究成年哺乳动物原本血管化组织中的从头血管生成提供了机会。即，从零开始启动完整的血管生成反应，克服测试组织内源性存在的血管生成抑制剂，这些抑制剂在小鼠所有正常组织中均发挥作用。然而，许多肠系膜窗中缺乏可作为母体微血管的原生微血管，这使得该检测在小鼠原始形态下具有不可预测性。

大鼠的肠系膜窗在正常情况下，成年大鼠中仅含有少量位于周边的小血管。这些肠系膜窗的天然厚度仅为5至10微米。这使得完整的组织能够铺展在载玻片上并进行显微观察，从而可以观察到每个窗内的所有血管，并使血管呈现出基本的二维延展形态。

该方法为定量测量血管微循环的空间延伸、密度、形成模式及尺寸提供了无与伦比的机会。皮下部位常用于血管生成研究，然而，由于内皮细胞的异质性及组织特异性特征，对皮下组织中血管生成的调控，以及皮下生长的肿瘤，可能无法准确预测对肺、肝、骨和脑等内脏器官转移性病变中血管生成的调控效果。这一点尤为重要，因为内脏转移通常是导致癌症致死的最终原因。

肠系膜窗具有内脏特性，这一点在该方面应具有优势。我们项目的目标是定量研究新生血管形成的相关特征。因此，我们向腹腔内注射已知的促血管生成因子或待测物质。

我们通常每次向成年未麻醉的大鼠注射五毫升液体。这种体积的注射液可迅速使整个肠系膜暴露于注入的液体中。任何经腹腔注射的溶液，只要其体积不过小，就应会影响测试组织中的所有细胞，尤其是覆盖在极薄的肠系膜窗上的间皮细胞层，该细胞层对溶质具有高度通透性。由于不涉及手术操作，因此在肠系膜窗中研究的血管生成不会受到创伤愈合相关血管生成的影响，因此血管生成干预以腹腔注射的形式给予。

出于实际考虑，我们在研究特定蛋白（如 VEGF 165、VEGF 164 和碱性 FGF）的促血管生成作用时，通常采用标准治疗方案，即从周一早晨至周五早晨连续五天、每天两次注射。一般以 Pharmacia 输注溶液作为溶剂。尽管治疗次数看似较多，但需注意的是，即使使用 VEGF 和碱性 FGF 等强效促血管生成因子，在接近生理水平的单次或少数间隔给药情况下，也并不总能诱导出具有统计学意义的血管生成；应牢记，组织中同时存在强效的内源性血管生成抑制因子。

血管生成调节治疗方式的给药模拟了临床治疗情境。可系统性、皮下、静脉内或口服给予一种或多种血管生成调节因子。例如。

这模拟了临床治疗情况，因为不仅可以研究母体分子的作用，还可以研究其代谢产物的作用。该系统允许在一定程度上控制全身给予的血管生成调节剂所产生的毒性效应。由于成年大鼠在生理上会持续生长，在持续两到三周的实验过程中体重可能增加约40%，因此通过称量动物体重，可以了解治疗对体重增长的抑制程度，而这一抑制程度可作为毒性效应的体现。

这可以避免使用对血管生成调节试验物质产生毒性剂量的情况。这是一个重要的优势，因为如果涉及毒性作用，则可能无法将结果解释为特异性的抗血管生成效应。由于成年大鼠的生长速度明显快于成年小鼠，因此毒性物质对体重增加的影响在大鼠中应比在小鼠中更敏感地反映总体毒性效应。

现在我们想向您展示如何制备肠系膜窗标本。这些动物使用 CO2 处死。将肠系膜窗从肠系膜远端开始，展平在普通的 3 英寸 × 1 英寸 载玻片上。

从回盲瓣开始逆行观察，肉眼无法看到肠系膜窗口中的血管生成。采用从肠系膜最远端获取的四个窗口。载玻片上的标本在室温下干燥20分钟。

切除肠残端。标本随后保存在零下20摄氏度的冷冻柜中。通过这种方法，标本可保存数月，甚至数年，而不会出现明显的质量下降。

使用抗大鼠内皮细胞的单克隆抗体进行染色，让标本在空气中自然干燥，不要用盖玻片封片。采用计算机辅助形态计量显微镜，结合绘图显微镜（总光学放大倍数为14至34倍），对各个肠系膜窗内的血管发生情况进行定量分析。整个肠系膜窗均需进行观察。

放大倍数选择固定的档位，以便尽可能使视野的大部分被标本覆盖。整个区域可轻松描绘出来，因为窗样组织与其周围脂肪组织之间的边界清晰。所有血管化部分随后依据明确定义的标准进行绘制。

即使是新形成的最小血管，在高倍放大下其直径也仅为约 2.5 至 3.0 微米，仍可被清晰识别。大鼠红细胞的平均直径等于或大于 6.3 微米，这一事实恰好说明了这些血管的尺寸之小。窗内所有血管化区域的面积占整个窗面积的百分比，称为相对血管化面积 va。

从各方面来看，这实际上是测量血管的空间延展性，因为血管本质上具有二维延展性，例如可通过计算机辅助遥测技术轻松测量血管面积（VA）。下一步是在每个观察窗血管化区域的三个中心部位，记录微血管密度及模式形成情况。这些部位在80倍光学放大下系统性地随机选取。

使用绘图显微镜将每个血管可视化为一条单线。每个视野的图像被转换为数字化图像并输入图像分析仪，随后数字化图像中的每个血管被缩减至一个像素的厚度。然后，仪器测量代表血管的像素数量，并以视野中所有像素的占比形式表示。

这一百分比数值，即微血管长度（MVL），表示在每个血管化单位面积内微血管的长度，是微血管密度的综合测量指标。通过将每只动物四个视野的血管面积（VA）平均值乘以相应处理组的平均MVL，可计算出每只动物的总微血管长度（TMVL）。此外，我们还开发了利用图像分析技术对微血管密度和组成进行详细定量分析的方法。

这些参数包括测量两个连续微血管之间的实际距离、分支点、IE，单个微血管的长度、LEMS节段长度，单位组织体积内的微血管数量、节段数（NOMS），以及单位组织体积内的微血管分支点数量（NOBP）。微血管扭曲度（MVT）通过两个连续分支点之间的最短距离与实际距离之差来确定，同时考虑微血管交叉发生的交叉指数（INIS）以及相互连接的环状结构形成情况。环状结构形成指数（INLF）也可采用类似技术在微血管网络的周边区域进行精确定量测量。

我们还能够定量测定芽体的相应变量，包括芽体长度（LESP）以及单位组织体积内的芽体数量（NOSP），在设计实验时需考虑同一处理组内不同动物之间，甚至同一动物不同肠系膜窗之间可能存在显著差异。我们发现以下实验设计可能较为实用：每组处理动物数量在观察时间内为8至12只；每只动物用于血管化分析（VA）的肠系膜窗数量；每个窗用于微血管长度（MVL）分析的视野数量；微血管段长度（LEMS）；微血管段数量（NOMS）；微血管分支点数量（NOBP）；微血管迂曲度（MVT）；交叉指数（I）；环形成指数（INF）。以三只接受载体处理的动物作为对照组。肠系膜窗血管生成检测法非常适用于剂量效应研究及血管生成动力学分析。

可以通过用不同剂量的促血管生成因子处理动物组，并在血管生成反应的不同时间点处死这些动物来实现。由此可以定量地分辨出血管生成的扩展阶段、峰值以及随后的血管退行阶段。此类研究显示，对任何经测试的生长因子或细胞因子而言，其从头开始的血管生成反应在速度、强度和持续时间方面均具有明确的剂量依赖性。

此外，与生理剂量下的 VEGF 或碱性 FGF 介导的血管生成相比，新血管在空间延伸、微血管变化及密度方面的模式通常表现出显著的剂量和时间依赖性。肥大细胞介导的血管生成（MCMA）通过原位选择性激活肥大细胞诱导，具有更强的效力和显著更长的持续时间。事实上，正是由于该检测方法能够定量评估客观的血管生成参数、系统具有高度的生物学相关性，并可检测治疗的毒性作用，肥大细胞介导的血管生成才首次通过此实验得以描述。

该方法特别适用于结构-活性关系和剂量反应分析。大鼠MWAA提供了一种在成年天然血管化内脏组织中研究血管生成的模型，该组织缺乏生理性的血管生成，且不受手术影响，从而排除了伤口愈合诱导的血管生成的任何干扰。该检测方法具有真正的定量性，能够准确评估多个描述微血管空间延伸、密度及模式形成的生物学相关客观变量。

该检测方法非常适合研究血管生成的系统性效应、调节因子，以及结构-活性关系和剂量-反应关系。本文所述方法由瑞典哥德堡大学汝卡大学医院病理学系Dr.Kloss Carl Norby实验室开发。本项目的所有研究均得到瑞典医学研究委员会（项目编号5 9 4 2）的资助。

我们衷心感谢自项目启动以来一直参与工作的贡·埃弗尔女士、未到场的莫妮卡·安德森女士以及安·内玛尔·林德格伦女士所提供的娴熟技术协助。

希望这个简短的介绍能让您了解该检测方法的潜力。如果您在实验室中使用此检测方法，且遇到任何技术问题，我将很乐意为您提供帮助。此外，我也非常欢迎您提出任何建议。

谢谢。