Name: 大鼠肠系膜血管生成法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 30 s
Description: 学习大鼠肠系膜血管生成法，通过腹腔注射促血管生成因子，定量研究成年哺乳动物组织中的血管新生过程。该方法可用于评估系统性给药对血管生成的调控作用，为癌症治疗研究提供重要实验模型。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

大多数研究的经费由瑞典医学研究委员会（资助号 5942）提供。

1. 动物
<ol>
	<li>小型啮齿类动物，如大鼠、小鼠和豚鼠，曾被用作动物模型。然而，成年小鼠（已评估多个品系）的肠系膜窗内通常缺乏或仅有极少量的潜在亲本微血管（即能够启动血管生成的微血管），这使得使用小鼠进行的研究结果不可靠。因此，该实验方法主要针对大鼠开发。</li>
	<li>大鼠在从繁殖单位接收后，需在标准环境中适应至少7天，通常每两只共养于一个标准笼具中，维持12小时光照/12小时黑暗的循环条件，并可自由获取饮水和颗粒饲料。每只动物均进行标记。我们主要使用年轻成年大鼠（通常为7–10周龄，来自不同品系，但通常为雄性Sprague-Dawley大鼠；5–6周龄以下的大鼠体内天然微血管数量往往较低），来源包括多个繁殖单位。在实验前及整个实验期间，每隔一天称重一次，且在处死当天必须称重。若动物同时接受腹腔注射（用于诱导血管生成，见下文）以及皮下、静脉或口服给药，则需每日称重。这有助于在实验开始时建立体重相等的实验组与对照组，并可监测治疗对实验过程中体重增长的影响。由于成年雄性大鼠具有较强的生理性生长能力（每周增重约40–60 g，具体取决于品系），体重增长迟缓可作为毒性、全身健康状况、厌食及发育不良的敏感替代指标。</li>
</ol>
我们在高标准的动物护理设施中开展工作，并尽最大努力减少动物所经历的压力。目前遵循的伦理准则由 Workman P. et al. 制定（《癌症研究中动物福利与使用的指南》，Br. J. Cancer 102, 1555-77, 2010）。哥德堡大学动物伦理委员会已批准本研究。 

2. 促血管生成的腹腔内治疗
<ol>
 <li>待测的候选促血管生成因子需溶解并稀释于无内毒素的生理盐水中（即使极低水平的内毒素也具有促血管生成作用）。所有溶液均于注射当日新鲜配制，经无菌过滤（Millipore 0.22 μm 滤膜），检测pH值为中性（7.1–7.3），并在室温下使用。 
 测试剂以低浓度或极低浓度注射。例如，大鼠 rVEGF164 (564-RV/CF；R&amp;D Systems Europe, Ltd., Oxon, 英国）生产的、在大鼠中占主导的VEGF-A亚型，用无内毒素的生理盐水稀释至96 pmol/ml，经冻融后，腹腔注射5 ml至大鼠体内。我们采用5 ml注射器配0.8 mm针头（绿色针头，21G）进行腹腔注射。该处理每日两次，持续4.5天。 即从周一早晨（第0天）到周五早晨（第4天）期间，在肠系膜检测组织中诱导出显著的出芽性血管生成反应，该反应在约第21天达到峰值。 
 腹腔注射该溶液可确保全部体积进入腹膜腔（而非肠道、膀胱或其他任何器官）。快速注射5 ml液体可使操作者通过触觉确认液体流已穿过腹壁进入腹腔。 
 随后，可在腹腔注射促血管生成治疗之前、同时或之后，系统性给予任何选定的试验药物。
 </li>
</ol>
3. 血管生成调节剂的全身给药
<ol>
	<li>除腹腔注射（i.p.）外，可采用任何其他给药途径，因为腹腔注射可能通过诱导炎症反应，或可能通过激活测试组织中的肥大细胞，影响正在进行的血管生成反应，从而引发强烈的促血管生成效应。除口服给药或皮下（s.c.）、静脉（i.v.）单次注射外，我们常采用渗透压微型泵进行皮下给药（可使用一个或多个泵，体积和泵送时间各异），以实现持续恒速给药，持续时间可达一至数周。</li>
	<li>持续皮下输注试验药物 
	渗透压微型泵的填充与植入 
	通常在第5天， 即， 在腹腔注射VEGF治疗结束后的第2天，于无菌条件下将渗透压微型泵（例如，型号2ML2，恒定泵速为5.0 μl/h，持续14–15天；Alzet Osmotic Pumps，Mountain View，CA，USA）填充待测药物或相应的溶剂。将泵置于无菌的0.9%（w/v）NaCl溶液中，于37°C过夜孵育后，通过手术将其皮下植入已使用异氟烷气体（Isoba vet；Schering-Plough Animal Health，Merck）麻醉的大鼠背部（脊柱侧肩胛骨区域）。 &amp; Co., Inc., Whitehouse Station, NJ, USA)，首先置于密闭透明舱内，随后通过面罩给予（为尽量减少对后续实验动物造成的应激，每次使用后均用空气冲洗舱体）。泵植入后立即使用丝线缝合皮肤切口。 
	由于动物在实验期间会生理性增重，而受试药物以恒定速率给药，因此所选测试药物按每千克体重计算的实际剂量在输注期开始时高于平均剂量，在输注期结束时低于平均剂量。 持续输注可被视为节律性治疗的一种延伸形式。
	</li>
</ol>
 4. 结束实验
 <ol>
 <li>每次将一只动物放入一个透明的密闭容器中，通入 CO2 气体使其迅速死亡。每次使用后需用空气冲洗容器，方可再次使用。</li>
</ol>
5. 收集组织样本
<ol>
 <li>如DVD所示，打开腹壁并识别小肠系膜，包括延伸至回盲瓣（小肠与大肠的连接处）的最远端部分。将位置最远端的四个（或更多）“窗状”系膜结构编号，并展平于标准未处理的Superfrost Plus载玻片（DAKO Denmark A/S，Glostrup，丹麦）上。应尽可能避免样本被血液、肠道内容物或其他体液污染，因为这些物质可能会产生非特异性染色，尽管这并不会影响后续对微血管的免疫组织化学可视化观察。</li>
 <li>每个带有附着小肠节段的系膜窗标本均展平于载玻片上，并在室温下干燥20分钟。随后切除肠残端，而完整的膜状系膜标本则可长期保存于-20°C环境中。此操作过程见DVD演示。</li> 
</ol>
需要指出的是，在收获组织之前，可利用透射光活体显微镜观察组织及通畅的血管系统。
6. 微血管免疫组织化学染色实验方案
<ol>
	<li>第0天 
	将样本从 -20°C 缓慢升至室温使其解冻，在 60°C 的烘箱中干燥 1 小时，然后于室温下放置过夜。
	</li>
	<li>第1天 
	将载玻片放入染色架中（每隔一个槽位放置），置于染色缸内，用 TBS（pH 7.8）在室温下洗涤两次，每次 10 分钟。弃去溶液，更换为下一步所用溶液，后续所有步骤依此类推。</li>
	<li>胰蛋白酶处理 
	将胰蛋白酶溶液加入将要放置染色片架的染色缸中（25°C，20分钟）。弃去溶液，用2.5%蔗糖溶液孵育两次（每次室温10分钟）。弃去溶液，用蒸馏水冲洗数次 去离子水 （室温下各放置几分钟）。
	</li>
	<li>封闭 
	将盛放染色玻片架的染色缸中装入0.5% H2O2 在甲醇中（室温下30分钟）。弃去溶液，用 去离子水 （室温放置数分钟）。弃去溶液，用 TBS（pH 7.4）洗涤两次，每次 8 分钟（室温）。
	</li>
	<li>
	孵育 
	所有孵育步骤均在室温下的湿盒中进行。每个载玻片使用以下所列溶液各约150 μl。将载玻片置于湿盒中，用移液器将溶液加至样本上（非膜部分无需覆盖溶液）。 
	在进行以下每一步操作时，均需在加入后续溶液前仔细将所有溶液摇净。
		<ol>
			<li>正常（封闭）血清孵育 （马）（ABC试剂盒）
			3滴 黄色溶液/10 ml 稀释缓冲液中孵育 20 分钟。
			</li>
			<li>一抗孵育 ARU0181，可标记大鼠血管内皮细胞。将抗体用稀释缓冲液（Biosource）按1:600稀释（100 μl 抗体原液经40倍稀释[冻存]后加入900 μl 稀释缓冲液），于4°C孵育过夜。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>第2天 
	将载玻片从湿盒中取出，弃去一抗，将载玻片放入染色架中，浸入染色缸，用TBS（pH 7.8）冲洗两次，每次8分钟。
		<ol>
			<li>与生物素化抗体孵育 （ABC试剂盒） 
			将载玻片水平放置于湿盒中，每张滴加1滴进行孵育 蓝色溶液加入10 ml稀释缓冲液，孵育30分钟。弃去溶液，将切片置于染色架中，浸入染色缸，用TBS（pH 7.4）冲洗两次，每次8分钟。
			</li><li> 与ABC试剂孵育 
载玻片再次水平放置于湿盒中，然后将以下溶液滴加到标本的膜状部位：2滴 橙色溶液 加上2滴 棕色溶液/10 ml TBS（pH 7.4）中孵育30分钟。轻柔混匀30分钟 之前 使用！弃去溶液，将切片放入染色缸的切片架中，用TBS（pH 7.4）冲洗两次，每次8分钟。
</li>
</ol>
</li>
<li>
DAB（0.05%）染色 
此步骤必须在通风橱中进行！ 
将切片放置好，并用移液器加入3,3-二氨基联苯胺（DAB；Sigma-Aldrich）溶液：将0.1% DAB溶液（溶于TBS，pH 7.4，冷冻保存）与10 μl H₂O₂的混合液等体积混合后使用2O2 以及7.5 ml TBS（pH 7.4）。该溶液在使用前需经无菌滤膜过滤（以去除可能影响显微观察的颗粒物）。将标本染色8分钟。弃去染液，将载玻片放入染色架中，并浸入染色缸内。用流动的自来水冲洗，随后用 去离子水 几分钟。
</li>
<li>脱水 
将载玻片保留在染色片架中。通过弃去并重新填充含有染色液的染色缸进行冲洗 去离子水/乙醇: 去离子水70% 乙醇、95% 乙醇、无水乙醇，每种溶液中各浸泡 2 分钟。</li>
</ol>
7. 血管内皮细胞免疫组织化学染色后对每个肠系膜窗标本微血管网络的成像与评估
如影片所示，微血管在显微镜下可见 原位 在完整组织中。
<ol>
	<li>首先，我们使用放大倍数范围为14至34倍的绘图显微镜（Leica Wild M 3Z），在白纸上用铅笔描出每个肠系膜窗的整个窗口区域以及全部血管化区域（VA）。VA占整个区域的百分比可通过计算机化或非计算机化的平面测量法轻松测定（也可通过剪下整个窗口图像及其所有血管化部分的图像并称重来简单估算）。</li>
	<li>利用另一台绘图显微镜，在随机选择的视野中以80倍放大倍数用黑色墨水在白纸上描绘出易于识别的单个微血管轮廓。这是后续对微血管长度（MVL）进行计算机辅助形态计量分析的起点，MVL本质上是微血管密度的测量指标。</li>
	<li>可选地，还可测定与微血管模式形成相关的参数，以及用于评估微血管芽数量和单个微血管芽长度（分别记为No. SP和Le. SP）的变量。描绘出的黑色血管结构与白色背景之间具有最佳对比度，有利于在大多数商用计算机化形态计量软件中对图像进行详细分析。</li>
	<li>在大多数情况下，主要变量为VA和MVL，二者相乘可得到总微血管长度（TMVL）。</li>
</ol> 
8. 统计分析
我们通常采用标准的非参数 Mann-Whitney U 检验来分析非配对（双尾）观察数据。每个动物的肠系膜窗口以四个视野的均值作为每个变量的独立数据点。统计学显著性的判定标准为 P ≤ 0.05。

<ol><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+models+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo models of angiogenesis.</a> J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+testing+with+angiogenesis+models%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug.+Discov%22%5BJournal%5D)">Drug testing with angiogenesis models.</a> Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).</li>
<li>Norrby, K., Jakobsson, A., Sorbo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast-cell-mediated+angiogenesis%3A+a+novel+experimental+model+using+the+rat+mesentery%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch.+B+Cell.+Pathol.+Incl.+Mol.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mast-cell-mediated angiogenesis: a novel experimental model using the rat mesentery.</a> Virchows Arch. B Cell. Pathol. Incl. Mol. Pathol. 52, 195-206 (1986).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cells+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Mast cells and angiogenesis.</a> APMIS. 110, 355-371 (2002).</li>
<li>Albertsson, P., Lennernas, B., Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+meteronomic+chemotherapy%3A+modulation+of+angiogenesis+mediated+by+VEGF-A%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oncol%22%5BJournal%5D)">On meteronomic chemotherapy: modulation of angiogenesis mediated by VEGF-A.</a> Acta Oncol. 45, 144-155 (2006).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+apo-lactoferrin+enhances+angiogenesis+mediated+by+vascular+endothelial+growth+factor+A+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Human apo-lactoferrin enhances angiogenesis mediated by vascular endothelial growth factor A in vivo.</a> J. Vasc. Res. 41, 293-304 (2004).</li>
<li>Norrby, K., Mattsby-Baltzer, I., Innocenti, M., &amp, T. uneberg, S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orally+administered+bovine+lactoferrin+systemically+inhibits+VEGF%28165%29-mediated+angiogenesis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Orally administered bovine lactoferrin systemically inhibits VEGF(165)-mediated angiogenesis in the rat.</a> Int. J. Cancer. 91, 236-240 (2001).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-molecular-weight+heparins+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Low-molecular-weight heparins and angiogenesis.</a> APMIS. 114, 79-102 (2006).</li>
<li>Norrby, K., Nordenhem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dalteparin%2C+a+low-molecular-weight+heparin%2C+promotes+angiogenesis+mediated+by+heparin-binding+VEGF-A+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Dalteparin, a low-molecular-weight heparin, promotes angiogenesis mediated by heparin-binding VEGF-A in vivo.</a> APMIS. 118, 949-957 (2010).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+fibroblast+growth+factor+and+de+novo+mammalian+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res.%22%5BJournal%5D)">Basic fibroblast growth factor and de novo mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res.. 48, 96-113 (1994).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor+and+de+novo+mammalian+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor and de novo mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res. 51, 153-163 (1996).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+density+in+terms+of+number+and+length+of+microvessel+segments+per+unit+tissue+volume+in+mammalian+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Microvascular density in terms of number and length of microvessel segments per unit tissue volume in mammalian angiogenesis.</a> Microvasc. Res. 55, 43-53 (1998).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

该检测方法于1986年首次提出3 并在我们的实验室中被持续地进一步开发和完善7,10-12如综述论文（特邀）中所述1, 2，该检测方法与其他哺乳动物的检测方法相比具有良好的可比性 在体内 在血管生成实验中，该方法具有若干重要优势：成年测试组织本身具有血管化特征，且缺乏生理性血管生成；对组织造成的创伤极小，甚至无创伤；可测量真正具有定量意义的变量，从而能够对剂量-反应关系及分子活性研究进行可靠的统计学分析；能够发生出芽式血管生成，而这种模式在正常组织和肿瘤中均占主导地位；此外，在生理状态稳健的成年大鼠中易于积累毒性数据。然而，该方法也存在一些不足之处：实验相对耗时，尤其是在评估单个微血管节段和微血管出芽的数量与长度时；无法实现对过程的实时或连续观察；此外，该方法在小鼠中应用极为困难，因为许多小鼠肠系膜窗缺乏可作为新生毛细血管起源的潜在母体微血管。
然而，通过活体显微镜技术可以实现实时观察，如文献1所述，在动物麻醉状态下，将外置但保持完整的肠系膜窗口展开并覆盖在显微镜载物台上进行观察。
过去几十年中，利用角膜微囊、鸡胚尿囊膜以及皮下Matrigel栓塞等模型，在血管生成研究领域已取得重大进展，这些模型虽然有用，但终究存在局限性。抗血管生成和促血管生成疗法未来的临床应用，迫切需要建立并验证更为敏感、更具生物学相关性且真正定量的临床前模型，例如本报告中所描述的模型。

<table><tbody><tr><td colspan="4">缓冲液与试剂</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;0.5 M Tris-HCl（pH 7.8）贮存液&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt;三（羟甲基）氨基甲烷（60.57 g）溶于约900 ml &lt;em&gt;去离子水&lt;/em&gt; 并加入约45 ml的25% HCl（浓盐酸）以调节pH至7.8，随后用 &lt;em&gt;去离子水&lt;/em&gt;.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tris-缓冲盐溶液（TBS；pH 7.8） &lt;/strong&gt;&lt;br/&gt;向200 ml贮备液中加入18 g NaCl，溶解于约1800 ml水中 &lt;em&gt;去离子水&lt;/em&gt; 使用储备液调节 pH 至 7.8，然后用溶剂定容至 2 升 &lt;em&gt;去离子水&lt;/em&gt;.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;TBS（pH 7.4）&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt;向200 ml贮备液中加入18 g NaCl，溶于约1800 ml水中 &lt;em&gt;去离子水&lt;/em&gt; 用储备液调节 pH 至 7.4，然后加水稀释至 2 升 &lt;em&gt;去离子水&lt;/em&gt;.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;胰蛋白酶溶液（0.05% 胰蛋白酶，0.1% CaCl₂）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt;含有 0.1 g 胰蛋白酶和 0.2 g CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 在 200 ml TBS（pH 7.8）中</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;2.5% 蔗糖溶液&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt;含 5 g 蔗糖的 200 ml TBS 溶液（pH 7.8）。</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1% 叠氮化钠在 TBS（pH 7.4）中的储备液&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt;含 1 g 叠氮化钠（Na-azide）的 100 ml TBS 溶液（pH 7.4）。</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;稀释缓冲液：0.1% BSA，0.01% Na-叠氮化物&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt;（用于稀释Vectastain ABC试剂盒中的抗体）。每100 ml TBS（pH 7.4）中含有0.1 g牛血清白蛋白（BSA）和1 ml 1%叠氮钠。</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;ABC试剂盒 Vectastain PK 4002，ABC辣根过氧化物酶小鼠IgG&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt;正常马血清；封闭血清 &lt;em&gt;黄色溶液&lt;/em&gt;3滴/10 ml稀释缓冲液&lt;br/&gt;生物素化抗体；抗小鼠IgG &lt;em&gt;蓝色溶液&lt;/em&gt;1滴/10 ml稀释缓冲液&lt;br/&gt;ABC试剂： &lt;em&gt;橙色溶液&lt;/em&gt;，2滴加 &lt;em&gt;棕色溶液&lt;/em&gt; 2滴/10 ml TBS（pH 7.4） </td></tr><tr><td colspan="4">将这些溶液混合20分钟 &lt;strong&gt;之前&lt;/strong&gt; 使用！</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;小鼠（单克隆）抗大鼠内皮细胞抗体&lt;/strong&gt;（Biosource International，Camarillo，CA，美国）</td></tr><tr><td colspan="4">该抗体针对大鼠体内所有血管内皮细胞，但脑组织中的内皮细胞除外。</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Vectastain 辣根过氧化物酶亲和素-生物素复合物（ABC）试剂盒&lt;/strong&gt;&lt;br/&gt;试剂盒包含一抗、生物素标记的二抗、亲和素-生物素化酶复合物（ABC）以及酶底物。参见 &lt;a href=&quot;http://www.vectorlabs.com/&quot;&gt;www.vectorlabs.com&lt;/a&gt; 或 &lt;a href=&quot;http://www.immunkemi.se/&quot;&gt;www.immunkemi.se&lt;/a&gt; 用于实验方案。</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;牛血清白蛋白&lt;/strong&gt;（BSA）（Sigma-Aldrich，货号 # A-4503）。&lt;br/&gt;&lt;strong&gt;DAB&lt;/strong&gt;= 3,3&amp;rsquo;-二氨基联苯胺 Isopac（Sigma-Aldrich，货号 # D 9015）&lt;br/&gt;&lt;strong&gt;胰蛋白酶&lt;/strong&gt;来自牛胰腺（Sigma-Aldrich，货号 # T 4665）。&lt;br/&gt;&lt;strong&gt;Vectastain 辣根过氧化物酶 ABC 试剂盒&lt;/strong&gt;，小鼠 IgG（Immunkemi F &amp;amp; D AB，Jarfalla，瑞典</td></tr></tbody></table>

大鼠肠系膜血管生成实验

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

成年大鼠肠系膜窗血管生成实验在生物学上具有合理性，且特别适用于出芽型血管生成的研究 体内 [参见综述性论文]，这是人类肿瘤及非肿瘤组织中占主导形式的血管生成方式，相关讨论见受邀综述论文1,2通过腹腔内（i.p.）注射促血管生成因子可在肠系膜膜状部分诱导血管生成，该过程可通过皮下（s.c.）、静脉内（i.v.）或口服（p.o.）给予选定的调节剂进行调控。肠系膜的每个膜状部分均呈半透明状，并由脂肪组织包绕，呈现出类似窗口的外观。
该检测具有以下优势：（i）测试组织本身具有血管化，尽管血管分布稀疏，但由于组织极薄，其微血管网络近乎二维结构，因此可借助显微镜对整个网络进行评估 原位； （ii）在成年大鼠中，待测组织缺乏显著的生理性血管生成，而后者是大多数正常成年哺乳动物组织的特征；然而，如文中所述，组织固有血管化程度与年龄相关。1（iii）创伤诱导的血管生成水平极低，可确保高灵敏度；（iv）该检测方法可模拟临床情况，因为用于调节血管生成的试验药物通过全身给药，所观察到的反应反映了治疗所引起的所有代谢、细胞和分子改变的综合效应；（v）该检测方法可对微血管空间扩展、密度及网络模式形成的客观、定量且无偏倚的变量，以及毛细血管出芽情况进行评估，从而支持对结果进行可靠的统计分析 剂量-效应 和 分子 
结构-活性 关系；以及（vi）该检测方法具有高灵敏度，能够揭示治疗措施对成年大鼠生理体重增长速率的毒性或有害影响，因为成年大鼠的体重增长显著。
肥大细胞介导的血管生成最初通过该实验方法得以证实3,4。该模型在剂量-效应关系以及系统给予的化学结构或功能相近的药物和蛋白质所产生的效应方面表现出高度的区分能力，包括：(i) 低剂量、节律性给药的标准化疗药物，可产生多样且药物特异性的效应（即，抑制血管生成、中性或促进血管生成的活性5）；(ii) 天然铁未饱和的人乳铁蛋白，可促进由 VEGF-A 介导的血管生成6，以及天然铁未饱和的牛乳铁蛋白，可抑制由 VEGF-A 介导的血管生成7；(iii) 通过不同方法制备的低分子量肝素组分8,9。此外，该实验方法非常适用于研究以同时或序贯方式系统给予的多种试剂对血管生成的联合效应。
制作本视频的想法源于已故的 Judah Folkman 博士访问我们实验室并目睹该方法的演示时。
综述论文（特邀），对检测方法进行讨论和评价
Norrby, K. 体内 血管生成模型. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. 使用血管生成模型进行药物测试。Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008)。

用于研究以下两方面的正常成年哺乳动物血管化组织：该组织不具有生理性血管生成，且未接受过外科干预；（i）在腹腔内给予试验物质后，血管生成的启动与发展过程；（ii）在系统性给予选定试验物质后，对血管生成的调控作用。

成年大鼠肠系膜窗血管生成实验在生物学上具有合理性，且特别适用于研究出芽式血管生成……

欢迎来到瑞典古滕堡盖恩大学医院病理科。我是克劳斯·诺比博士，您即将看到的方法由我的实验室开发。临床上相关的血管生成通常在缺氧、实体瘤或任何其他血管生成性疾病中发生，几乎 exclusively 发生在具有天然血管化的组织中。在成年小型啮齿类动物中，连接小肠与体腔后壁的肠系膜含有多个薄而膜状的区域。在大鼠中，这类肠系膜窗大约有 40 至 50 个。它们几乎透明，肉眼观察时形似窗口，每个窗口周围均被脂肪组织包围。肠系膜窗原本具有血管化特征，且无明显的生理性血管生成。因此，它们为研究成年哺乳动物原本血管化组织中的从头血管生成提供了机会。即，从零开始启动完整的血管生成反应，克服测试组织内源性存在的血管生成抑制剂，这些抑制剂在小鼠所有正常组织中均发挥作用。然而，许多肠系膜窗中缺乏可作为母体微血管的原生微血管，这使得该检测在小鼠原始形态下具有不可预测性。大鼠的肠系膜窗在正常情况下，成年大鼠中仅含有少量位于周边的小血管。这些肠系膜窗的天然厚度仅为5至10微米。这使得完整的组织能够铺展在载玻片上并进行显微观察，从而可以观察到每个窗内的所有血管，并使血管呈现出基本的二维延展形态。该方法为定量测量血管微循环的空间延伸、密度、形成模式及尺寸提供了无与伦比的机会。皮下部位常用于血管生成研究，然而，由于内皮细胞的异质性及组织特异性特征，对皮下组织中血管生成的调控，以及皮下生长的肿瘤，可能无法准确预测对肺、肝、骨和脑等内脏器官转移性病变中血管生成的调控效果。这一点尤为重要，因为内脏转移通常是导致癌症致死的最终原因。肠系膜窗具有内脏特性，这一点在该方面应具有优势。我们项目的目标是定量研究新生血管形成的相关特征。因此，我们向腹腔内注射已知的促血管生成因子或待测物质。我们通常每次向成年未麻醉的大鼠注射五毫升液体。这种体积的注射液可迅速使整个肠系膜暴露于注入的液体中。任何经腹腔注射的溶液，只要其体积不过小，就应会影响测试组织中的所有细胞，尤其是覆盖在极薄的肠系膜窗上的间皮细胞层，该细胞层对溶质具有高度通透性。由于不涉及手术操作，因此在肠系膜窗中研究的血管生成不会受到创伤愈合相关血管生成的影响，因此血管生成干预以腹腔注射的形式给予。出于实际考虑，我们在研究特定蛋白（如 VEGF 165、VEGF 164 和碱性 FGF）的促血管生成作用时，通常采用标准治疗方案，即从周一早晨至周五早晨连续五天、每天两次注射。一般以 Pharmacia 输注溶液作为溶剂。尽管治疗次数看似较多，但需注意的是，即使使用 VEGF 和碱性 FGF 等强效促血管生成因子，在接近生理水平的单次或少数间隔给药情况下，也并不总能诱导出具有统计学意义的血管生成；应牢记，组织中同时存在强效的内源性血管生成抑制因子。血管生成调节治疗方式的给药模拟了临床治疗情境。可系统性、皮下、静脉内或口服给予一种或多种血管生成调节因子。例如。这模拟了临床治疗情况，因为不仅可以研究母体分子的作用，还可以研究其代谢产物的作用。该系统允许在一定程度上控制全身给予的血管生成调节剂所产生的毒性效应。由于成年大鼠在生理上会持续生长，在持续两到三周的实验过程中体重可能增加约40%，因此通过称量动物体重，可以了解治疗对体重增长的抑制程度，而这一抑制程度可作为毒性效应的体现。这可以避免使用对血管生成调节试验物质产生毒性剂量的情况。这是一个重要的优势，因为如果涉及毒性作用，则可能无法将结果解释为特异性的抗血管生成效应。由于成年大鼠的生长速度明显快于成年小鼠，因此毒性物质对体重增加的影响在大鼠中应比在小鼠中更敏感地反映总体毒性效应。现在我们想向您展示如何制备肠系膜窗标本。这些动物使用 CO2 处死。将肠系膜窗从肠系膜远端开始，展平在普通的 3 英寸 × 1 英寸 载玻片上。从回盲瓣开始逆行观察，肉眼无法看到肠系膜窗口中的血管生成。采用从肠系膜最远端获取的四个窗口。载玻片上的标本在室温下干燥20分钟。切除肠残端。标本随后保存在零下20摄氏度的冷冻柜中。通过这种方法，标本可保存数月，甚至数年，而不会出现明显的质量下降。使用抗大鼠内皮细胞的单克隆抗体进行染色，让标本在空气中自然干燥，不要用盖玻片封片。采用计算机辅助形态计量显微镜，结合绘图显微镜（总光学放大倍数为14至34倍），对各个肠系膜窗内的血管发生情况进行定量分析。整个肠系膜窗均需进行观察。放大倍数选择固定的档位，以便尽可能使视野的大部分被标本覆盖。整个区域可轻松描绘出来，因为窗样组织与其周围脂肪组织之间的边界清晰。所有血管化部分随后依据明确定义的标准进行绘制。即使是新形成的最小血管，在高倍放大下其直径也仅为约 2.5 至 3.0 微米，仍可被清晰识别。大鼠红细胞的平均直径等于或大于 6.3 微米，这一事实恰好说明了这些血管的尺寸之小。窗内所有血管化区域的面积占整个窗面积的百分比，称为相对血管化面积 va。从各方面来看，这实际上是测量血管的空间延展性，因为血管本质上具有二维延展性，例如可通过计算机辅助遥测技术轻松测量血管面积（VA）。下一步是在每个观察窗血管化区域的三个中心部位，记录微血管密度及模式形成情况。这些部位在80倍光学放大下系统性地随机选取。使用绘图显微镜将每个血管可视化为一条单线。每个视野的图像被转换为数字化图像并输入图像分析仪，随后数字化图像中的每个血管被缩减至一个像素的厚度。然后，仪器测量代表血管的像素数量，并以视野中所有像素的占比形式表示。这一百分比数值，即微血管长度（MVL），表示在每个血管化单位面积内微血管的长度，是微血管密度的综合测量指标。通过将每只动物四个视野的血管面积（VA）平均值乘以相应处理组的平均MVL，可计算出每只动物的总微血管长度（TMVL）。此外，我们还开发了利用图像分析技术对微血管密度和组成进行详细定量分析的方法。这些参数包括测量两个连续微血管之间的实际距离、分支点、IE，单个微血管的长度、LEMS节段长度，单位组织体积内的微血管数量、节段数（NOMS），以及单位组织体积内的微血管分支点数量（NOBP）。微血管扭曲度（MVT）通过两个连续分支点之间的最短距离与实际距离之差来确定，同时考虑微血管交叉发生的交叉指数（INIS）以及相互连接的环状结构形成情况。环状结构形成指数（INLF）也可采用类似技术在微血管网络的周边区域进行精确定量测量。我们还能够定量测定芽体的相应变量，包括芽体长度（LESP）以及单位组织体积内的芽体数量（NOSP），在设计实验时需考虑同一处理组内不同动物之间，甚至同一动物不同肠系膜窗之间可能存在显著差异。我们发现以下实验设计可能较为实用：每组处理动物数量在观察时间内为8至12只；每只动物用于血管化分析（VA）的肠系膜窗数量；每个窗用于微血管长度（MVL）分析的视野数量；微血管段长度（LEMS）；微血管段数量（NOMS）；微血管分支点数量（NOBP）；微血管迂曲度（MVT）；交叉指数（I）；环形成指数（INF）。以三只接受载体处理的动物作为对照组。肠系膜窗血管生成检测法非常适用于剂量效应研究及血管生成动力学分析。可以通过用不同剂量的促血管生成因子处理动物组，并在血管生成反应的不同时间点处死这些动物来实现。由此可以定量地分辨出血管生成的扩展阶段、峰值以及随后的血管退行阶段。此类研究显示，对任何经测试的生长因子或细胞因子而言，其从头开始的血管生成反应在速度、强度和持续时间方面均具有明确的剂量依赖性。此外，与生理剂量下的 VEGF 或碱性 FGF 介导的血管生成相比，新血管在空间延伸、微血管变化及密度方面的模式通常表现出显著的剂量和时间依赖性。肥大细胞介导的血管生成（MCMA）通过原位选择性激活肥大细胞诱导，具有更强的效力和显著更长的持续时间。事实上，正是由于该检测方法能够定量评估客观的血管生成参数、系统具有高度的生物学相关性，并可检测治疗的毒性作用，肥大细胞介导的血管生成才首次通过此实验得以描述。该方法特别适用于结构-活性关系和剂量反应分析。大鼠MWAA提供了一种在成年天然血管化内脏组织中研究血管生成的模型，该组织缺乏生理性的血管生成，且不受手术影响，从而排除了伤口愈合诱导的血管生成的任何干扰。该检测方法具有真正的定量性，能够准确评估多个描述微血管空间延伸、密度及模式形成的生物学相关客观变量。该检测方法非常适合研究血管生成的系统性效应、调节因子，以及结构-活性关系和剂量-反应关系。本文所述方法由瑞典哥德堡大学汝卡大学医院病理学系Dr.Kloss Carl Norby实验室开发。本项目的所有研究均得到瑞典医学研究委员会（项目编号5 9 4 2）的资助。我们衷心感谢自项目启动以来一直参与工作的贡·埃弗尔女士、未到场的莫妮卡·安德森女士以及安·内玛尔·林德格伦女士所提供的娴熟技术协助。希望这个简短的介绍能让您了解该检测方法的潜力。如果您在实验室中使用此检测方法，且遇到任何技术问题，我将很乐意为您提供帮助。此外，我也非常欢迎您提出任何建议。谢谢。

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

大鼠肠系膜血管生成法

本视频展示了一种利用免疫缺陷大鼠模型中的人体血管（IMA）研究支架植入后内膜增生发展的模型。...

人内乳动脉（IMA）移植与支架植入：研究支架内再狭窄发生的人体模型

本文介绍了一种用于刺激大鼠肠系膜血管生成的简单模型。该模型可在相对较短的时间内显著促进毛细血管出芽、增加血管面积和血管密度，且所用组织可实现整个微血管网络的正面对观察，观察精度可达单细胞水平。...

大鼠肠系膜外翻：研究血管生成过程中细胞动态变化的模型

人类多发性骨髓瘤（MM）细胞的存活和增殖需要间充质细胞和细胞外基质成分所提供的支持性微环境。我们建立了一种将人类骨髓瘤细胞和间充质细胞移植入鸡胚的体内模型，用于研究抗癌药物对肿瘤生长、侵袭和血管生成的影响。...

建立人多发性骨髓瘤鸡异种移植模型以研究肿瘤生长、侵袭和血管生成

改良的Landis技术能够利用微灌注技术，在对照和实验条件下，对正常大鼠和基因修饰大鼠肠系膜中单个微血管的水力电导率进行配对测量。该方法为评估在生理条件下调控微血管通透性和跨血管交换的机制提供了一种便捷的手段。...

微灌流技术用于研究大鼠肠系膜微血管通透性的调控机制

本论文描述了一种管形成实验，通过在受控环境中利用内皮细胞的管形成能力，来定量评估特定化合物或条件对血管生成的影响。...

内皮细胞管形成实验的优化策略：比较细胞外基质与生长因子减除型细胞外基质

血管生成涉及多种细胞和多系统的相互作用，需要在生理相关的环境中进行研究。本研究的目的是展示大鼠肠系膜培养模型在血管生成过程中对完整的微血管网络进行延时比较的能力。...

一个 离体 延时成像培养大鼠肠系膜微血管网络的方法

本文介绍了一种主动脉环实验的新应用，其中预先标记的间充质细胞与大鼠主动脉来源的内皮网络共培养。该新方法可实现对间充质基质细胞（MSCs）归巢及其与内皮网络整合过程的可视化，对网络特性的定量分析，以及对MSC免疫表型和基因表达的评估。...

主动脉环共培养实验：一种体外评估间充质基质细胞促血管生成潜能的便捷工具 In Vitro

本文介绍了一种下肢缺血的实验模型，并结合一系列功能学、组织学和分子生物学检测方法 ，用于评估促血管生成疗法的有效性。​...

评估小鼠后肢缺血模型中的治疗性血管生成

我们描述了两种方法，用于评估与转移微环境（TMEM）通道功能及癌细胞内渗相关的短暂性血管通透性，该方法通过向小鼠静脉注射高分子量（155...

利用活体成像与固定组织分析评估与癌细胞播散相关的转移门户介导的血管通透性肿瘤微环境

在此，我们展示了将抗血管生成性肿瘤相关中性粒细胞转移至荷瘤小鼠后所表现出的治疗潜力。该方案可用于在体外调控中性粒细胞活性，并进一步在体内评估其功能。 在肿瘤发生过程中.

将经处理的肿瘤相关中性粒细胞转移至荷瘤小鼠以研究其体内促血管生成潜能

本方案可实现对经典方法中形成的管状结构的回收 体外...

从血管生成-管腔形成实验中回收滋养层细胞用于分化标志物表达分析

学习大鼠肠系膜血管生成法，通过腹腔注射促血管生成因子，定量研究成年哺乳动物组织中的血管新生过程。该方法可用于评估系统性给药对血管生成的调控作用，为癌症治疗研究提供重要实验模型。

大鼠肠系膜血管生成实验

探索更多视频