0 次观看 • 6:08 分钟 • July 8th, 2025
取一个含有分枝杆菌的多孔板。向各孔中加入浓度递增的待测化合物。
孵育。根据化合物对分枝杆菌的作用，它可能抑制分枝杆菌的生长，表现出抑菌活性，或清除分枝杆菌，表现出杀菌活性。
将孔中的等分试样转移至含有活性炭琼脂的炭吸附瑞萨辛测定（CARA）微孔板中，利用活性炭吸附待测化合物，以防止残留效应。
孵育。该化合物的抑菌活性可抑制分枝杆菌的复制，而杀菌活性则可降低分枝杆菌的存活能力。
向孔中加入缓冲液、刃天青及非离子型表面活性剂，以使刃天青在孔中分散。
在代谢活跃的分枝杆菌中，脱氢酶将呈蓝色、弱荧光的刃天青还原为粉红色、具有荧光的试卤灵。
使用酶标仪测量各孔中刃天青的荧光。
缺乏试卤灵荧光的孔表明该化合物具有杀菌活性。
不同孔中荧光强度的差异反映了活菌数量，体现了受试化合物浓度依赖性的杀菌或抑菌效力。
将耻垢分枝杆菌（M. smegmatis）接种于含有4或20毫升Middlebrook 7H9-ADN或7H9-OADC培养基的聚丙烯圆底或锥形离心管中，接种量使OD580达到0.01至0.1。在37摄氏度、20% O2条件下振荡培养M. smegmatis菌液，使其生长至对数中期，即OD580约为0.5。
为了在复制和非复制条件下建立最小抑菌浓度实验，将200微升OD580 为0.01的7H9-ADN细胞悬液加入至透明底、经组织培养处理的96孔板的所有孔中。
对于非复制性实验，使用含有0.02% tyloxapol 的 PBS 洗涤细胞两次，并用非复制性培养基重悬细胞。用非复制性培养基将细胞稀释至 OD580 为 0.1，然后加入亚硝酸钠，使其终浓度为 0.5 至 5 毫摩尔，亚硝酸钠母液为新配制的 1 摩尔溶液。
将光密度 OD580 为 0.1 的细胞悬液各 200 微升均匀分配至经组织培养处理的透明底 96 孔板的各个孔中。根据正文实验方案配制待测试剂后，向 A 至 E 行各孔中加入 2 微升待测试剂 #1，向 E 至 H 行各孔中加入 2 微升待测试剂 #2，充分混匀。
进行重复实验时，将 M. smegmatis 微孔板在 37 摄氏度、20% O2 和 5% CO2 条件下孵育 1 至 48 小时。在需要使用 CARA 作为检测读数的时间点，使用设定为 50 至 75 微升的 P200 多通道移液器，通过上下吹打 5 至 10 次，小心地重悬 MIC90 样式测定板各孔中的内容物。然后，使用移液器吸头以圆周运动方式轻轻搅动各孔中的液体。
将10微升未稀释的检测孔内容物转移至CARA微孔板中对应的孔内，转移过程中避免飞溅，并确保10微升的等分试样准确点样至CARA微孔板孔的中央。使用微孔板封板膜将CARA微孔板叠放密封，然后将其放入可重复封口的塑料袋中。将M. smegmatis CARA微孔板在37摄氏度、20% O2条件下孵育，复制型板孵育一至两天，非复制型板孵育两至三天。
当阴性对照孔中出现细菌生长的菌膜或较大的宏观菌落时，使用一套12个P200吸头配合多通道移液器，沿孔壁侧面加入40微升无菌PBS，使PBS扩散覆盖琼脂表面的细菌微菌落。
通过将5毫克刃天青与50毫升含5%吐温-80的PBS混合，配制CARA显色试剂。向CARA微孔板的每个孔中加入50微升 freshly prepared CARA显色试剂。然后，将板轻轻前后摇晃数次，以帮助试剂在各孔的琼脂和细菌层中均匀分布。将板放入可密封的塑料袋中，在37摄氏度下孵育至少30分钟，适用于M. smegmatis。
在读取荧光之前，将 CARA 微孔板置于生物安全柜中，室温下静置 15 分钟，并移除盖子。当在生物安全柜外使用 BSL3 分光光度计时，需在微孔板表面贴上光学级 PCR 封膜，并用柔软的纸巾轻轻按压封膜表面，确保密封紧密。测定荧光 通过 在530纳米激发、590纳米发射条件下进行检测。