一种用于检测巨噬细胞中 TLR 依赖性 NF-κB/AP-1 转录因子信号通路的实验方法

取含有报告型巨噬细胞的试管，这些巨噬细胞携带在可诱导启动子调控下的分泌型胚胎碱性磷酸酶（SEAP）基因。

在一个试管中，加入一种针对巨噬细胞Toll样受体2（TLR2）的特异性抗体，以中和其活性。

在另一个样本中，加入一种抑制剂以抑制 TLR4 信号传导。最后一个试管不作任何处理。

取一个带有吸附层的多室载玻片，该吸附层含有损伤相关分子模式（DAMPs）——即细胞坏死过程中释放的蛋白质。

将经处理和未处理的巨噬细胞分别加入不同的孔中，并进行孵育。

未处理的巨噬细胞上的 TLR2 和 TLR4 可结合损伤相关分子模式（DAMPs），从而激活转录因子核因子-κB（NF-κB）和激活蛋白-1（AP-1）。

这些因子转位至细胞核并结合SEAP启动子，上调SEAP的表达，后者被分泌至细胞外。

将含有SEAP的上清液转移至含有显色底物的微孔板中。

SEAP 水解底物，生成紫蓝色产物。测定吸光度。

TLR2中和显著降低SEAP的产生，表明TLR2是主要的介导分子。

为了评估吸附蛋白层对Toll样受体介导的NF-kB/AP-1活性的影响，在适当大小的培养瓶中将报告基因巨噬细胞培养至70%汇合度后，使用适当的酶解离溶液将细胞解离，操作如图所示。

用检测培养基将细胞重悬至浓度为 7.3 × 10⁵ 个细胞/毫升，并将细胞均匀分装至三个试管中。向第一个试管中的细胞加入终浓度为 1 微克/毫升的 TLR4 抑制剂，在室温下处理 60 分钟；向第二个试管中的细胞加入终浓度为 50 微克/毫升的抗 TLR2 抗体，在室温下处理 30 分钟；第三个试管在室温下不作处理，作为对照。

在细胞孵育的同时，每种条件下向三个黏附孔中分别加入 200 微升裂解液和 10% 胎牛血清。在 37 摄氏度下孵育适当的实验时间，使蛋白质吸附；然后使用新的巴斯德移液管吸取各孔中的蛋白溶液，并用 PBS 每孔 250 微升洗涤黏附孔表面三次，每次洗涤 5 分钟。

在报告基因巨噬细胞处理结束时，向每个孔中加入200微升细胞悬液。向其中两个孔中加入Pam3CSK4，使其终浓度为每毫升150纳克，作为TLR2阳性对照，如示意图所示。

作为 TLR4 阳性对照，在两个孔中加入脂多糖，使其终浓度为每毫升 1.5 微克。在 37 摄氏度孵育 20 小时后，从每个孔中取 20 微升上清液，以复孔形式加入 96 孔板中，同时设置三孔，每孔加入 20 微升检测培养基作为背景对照。

接下来，向每个孔中加入 200 µL SEAP 报告基因检测试剂，用粘性封板膜封板，在 37 °C 下孵育 2.5 小时。将剩余的上清液转移至每孔对应的 1.5 mL 离心管中，通过离心沉淀残渣。然后将上清液转移至新的 1.5 mL 离心管中，于 -80 °C 保存，用于后续通过 ELISA 进行促炎性细胞因子分析。孵育结束后，从板上移除粘性封板膜，并