0 次观看 • 5:54 分钟 • July 8th, 2025
取一块多孔板，其中含有在无血清培养基中培养的小鼠成纤维细胞。加入TNFα特异性抗体的系列稀释液。
加入TNFα——一种炎性细胞因子。
孵育。血清剥夺会诱导细胞产生应激，使细胞易于发生TNFα介导的凋亡。
TNFα 与血清剥夺细胞上的受体结合，可触发细胞内信号级联反应，激活胱天蛋白酶级联反应，从而诱导细胞凋亡。
然而，抗体与TNFα结合可阻止其与受体结合，从而抑制caspase的激活。
孵育结束后，加入含有去垢剂、促发光半胱天冬酶底物、荧光素酶以及ATP和镁离子的试剂混合物。混匀后进行孵育。
去垢剂使膜通透化，从而从TNFα诱导的细胞中释放出半胱天冬酶（caspases）。
该生物发光底物含有半胱天冬酶识别位点。特定的半胱天冬酶可切割该底物，生成氨基荧光素。
荧光素酶氧化其底物氨基荧光素，从而产生发光现象。
通过检测发光强度随抗体浓度增加而下降的现象，来测定发光强度，从而评估TNFα特异性抗体中和TNFα并抑制TNFα诱导的细胞凋亡的能力。
从第2列到第11列，向检测板内部的60个孔中每孔加入50微升细胞悬液。通过移液混匀细胞悬液，以向微孔板中添加等分试样。立即向检测板中转移50微升已制备好的稀释液。
对于平行加样，通过旋转移液器来分配稀释液。可按以下顺序将已规划的稀释液加入各孔中。对照品加入周围孔内。
用500微升超纯水稀释TNF-α，在2,200 RPM条件下使用涡旋振荡器混匀。转移至15 mL离心管中，最后用检测培养基稀释至40纳克/毫升。将50微升凋亡诱导溶液加入96孔板的60个外周孔中。将50微升凋亡诱导溶液加入96孔板的60个内部检测孔中。最后，孵育16小时。
第5天，按照生产商说明书的要求，用其缓冲液溶液重悬底物。通过倒置混合5次。分装底物溶液，并向检测板中每个样品孔加入50 µL底物溶液。同时向对照孔中加入底物。将检测板在涡旋混合器上以400 RPM振荡3分钟。
从混匀器中取出检测板，在室温下孵育。打开酶标仪分光光度计。启动 Softmax Pro 软件或任何等效程序。将微孔板放入分光光度计中，并调整以下参数。
将仪器的发光功能设置为终点检测模式。调整检测区域，排除第1列和第12列。选择酶标板类型为96孔标准透明底微孔板。将积分时间调整至1250毫秒。设置微孔板振板时间为10秒。选择放置参考物质、分析物质和对照样品的孔位。开始读数。