0 次观看 • 4:25 分钟 • July 8th, 2025
获取含有针对猴免疫缺陷病毒(SIV)的CD8+记忆T细胞的非人灵长类外周血单个核细胞(PBMCs)。
加入蛋白激酶抑制剂,以防止T细胞受体(TCR)在后续刺激后发生内化。
介绍肽-主要组织相容性复合体I类(pMHC-I)四聚体,即由四个与SIV特异性肽段结合的MHC-I分子组成的荧光素标记复合物。这些肽段可结合T细胞表面的T细胞受体(TCR)。
加入含有荧光染料偶联的抗体的混合物,这些抗体靶向结合CD8、CD28和CCR7——用于界定记忆T细胞亚群的标志物——以及标记非CD8+细胞的抗体。
一种荧光活力染料可标记死细胞。
固定细胞。对细胞进行透化处理以接触细胞内靶标。
加入与CD3(一种T细胞标志物)和细胞内颗粒酶 B(一种活化的CD8+ T细胞标志物)结合的荧光素偶联抗体。
通过流式细胞术排除非CD8+ T细胞和死细胞。
CD8阳性pMHC-I四聚体标记的T细胞+ T细胞以表征不同记忆CD8+ 基于颗粒酶B、CD28和CCR7水平的T细胞亚群
首先将恒河猴外周血单个核细胞(PBMCs)重悬于R-10培养基中,细胞浓度为1.6 × 10⁷ 个细胞/毫升。取50 µL细胞悬液分装至适量的流式细胞术检测管中,每管加入50 µL蛋白激酶抑制剂。涡旋混匀各管,并将样本在37°C孵育30分钟。
必须将适量的滴定肽-MHC四聚体稀释至足够体积的主混合液中,以用于所有实验管的染色。因此,为避免移液误差,制备主混合液时应多准备15%的过量。
在细胞孵育的同时,通过离心沉淀蛋白聚集体和四聚体溶液,以尽量减少背景染色。接下来,用适量的染色缓冲液稀释四聚体,使每管流式细胞术样品中可加入25微升四聚体混合液。然后涡旋混匀样品管,并将PBMC四聚体溶液在室温避光条件下孵育45分钟。孵育结束后,向相应的样品管中加入50微升染色混合液,并通过涡旋混匀各管。
室温避光孵育25分钟后,用洗涤缓冲液洗涤细胞,离心沉淀细胞,并小心倾去上清液,避免扰动沉淀。将各管中残留的缓冲液混匀,每管加入250 µL 2%多聚甲醛固定样本。立即混匀并置于4 °C避光孵育。20分钟后,用新鲜洗涤缓冲液洗涤细胞,离心沉淀细胞,并小心倾去上清液,避免扰动沉淀。
将细胞重悬于 500 微升破膜缓冲液中,涡旋混匀,于室温避光孵育 10 分钟。随后,洗涤并离心收集细胞。然后,如前所述弃去上清液。接下来,向相应的试管中加入 50 微升细胞内染色母液。涡旋混匀每份样品,并于室温避光孵育 30 分钟。孵育结束后,再次洗涤并离心收集细胞。样品现可上流式细胞仪检测。
本文介绍了一种利用流式细胞术对非人灵长类动物中CD8+记忆T细胞亚群进行表征的方法。该方案涉及使用pMHC-I四聚体及多种抗体来鉴定和分析T细胞群体。
准确鉴定和表征抗原特异性的CD8+记忆T细胞对于降低免疫学靶点的风险以及指导临床前模型中的疫苗和免疫治疗策略至关重要。肽-MHC-I四聚体染色技术可实现对SIV特异性T细胞亚群的高可信度定量和表型分析,支持可预测的免疫监测和转化研究的连续性。该技术能力有助于加强传染病和肿瘤免疫学项目中的早期发现与靶点验证工作流程。
这种基于四聚体的流式细胞术方法可融入从发现到临床前研究的连续流程,架起早期免疫靶点验证与转化生物标志物开发之间的桥梁。
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最后更新:29 八月 2026