一种用于分析SIV特异性CD8⁺记忆T细胞的肽-MHC-I四聚体染色技术

获取含有针对猴免疫缺陷病毒（SIV）的CD8⁺记忆T细胞的非人灵长类外周血单个核细胞（PBMCs）。

加入蛋白激酶抑制剂，以防止T细胞受体（TCR）在后续刺激后发生内化。

介绍肽-主要组织相容性复合体I类（pMHC-I）四聚体，即由四个与SIV特异性肽段结合的MHC-I分子组成的荧光素标记复合物。这些肽段可结合T细胞表面的T细胞受体（TCR）。

加入含有荧光染料偶联的抗体的混合物，这些抗体靶向结合CD8、CD28和CCR7——用于界定记忆T细胞亚群的标志物——以及标记非CD8⁺细胞的抗体。

一种荧光活力染料可标记死细胞。

固定细胞。对细胞进行透化处理以接触细胞内靶标。

加入与CD3（一种T细胞标志物）和细胞内颗粒酶 B（一种活化的CD8⁺ T细胞标志物）结合的荧光素偶联抗体。

通过流式细胞术排除非CD8⁺ T细胞和死细胞。

CD8阳性pMHC-I四聚体标记的T细胞⁺ T细胞以表征不同记忆CD8⁺ 基于颗粒酶B、CD28和CCR7水平的T细胞亚群

首先将恒河猴外周血单个核细胞（PBMCs）重悬于R-10培养基中，细胞浓度为1.6 × 10⁷ 个细胞/毫升。取50 µL细胞悬液分装至适量的流式细胞术检测管中，每管加入50 µL蛋白激酶抑制剂。涡旋混匀各管，并将样本在37°C孵育30分钟。

必须将适量的滴定肽-MHC四聚体稀释至足够体积的主混合液中，以用于所有实验管的染色。因此，为避免移液误差，制备主混合液时应多准备15%的过量。

在细胞孵育的同时，通过离心沉淀蛋白聚集体和四聚体溶液，以尽量减少背景染色。接下来，用适量的染色缓冲液稀释四聚体，使每管流式细胞术样品中可加入25微升四聚体混合液。然后涡旋混匀样品管，并将PBMC四聚体溶液在室温避光条件下孵育45分钟。孵育结束后，向相应的样品管中加入50微升染色混合液，并通过涡旋混匀各管。

室温避光孵育25分钟后，用洗涤缓冲液洗涤细胞，离心沉淀细胞，并小心倾去上清液，避免扰动沉淀。将各管中残留的缓冲液混匀，每管加入250 µL 2%多聚甲醛固定样本。立即混匀并置于4 °C避光孵育。20分钟后，用新鲜洗涤缓冲液洗涤细胞，离心沉淀细胞，并小心倾去上清液，避免扰动沉淀。

将细胞重悬于 500 微升破膜缓冲液中，涡旋混匀，于室温避光孵育 10 分钟。随后，洗涤并离心收集细胞。然后，如前所述弃去上清液。接下来，向相应的试管中加入 50 微升细胞内染色母液。涡旋混匀每份样品，并于室温避光孵育 30 分钟。孵育结束后，再次洗涤并离心收集细胞。样品现可上流式细胞仪检测。