基于局域表面等离子体共振成像的单细胞蛋白分泌检测

从一块带有功能化金纳米结构阵列的玻璃传感器芯片开始，该阵列表面具有含羧基的自组装单分子层。

将芯片固定在微流控装置中，并引入连接分子以活化羧基。

加入肽配体，使其与活化的羧基发生偶联 通过 连接子

用含有失活剂化合物的缓冲液处理，以封闭非特异性结合位点，并用缓冲液洗涤。

将偏振光聚焦到芯片上。使用局域表面等离子体共振成像系统，获取阵列的图像——在暗背景上呈现为明亮的方块。

在共振角处，金的电子会吸收光。测量相应角度下的反射光强度，以获得传感器响应。

引入分泌蛋白质的杂交瘤细胞，使其与芯片结合并进行洗涤。

贴壁细胞会分泌与邻近阵列上配体相互作用的蛋白质。

这些相互作用改变了反射光的角度和强度，导致传感器响应发生变化，从而证实了细胞的分泌活性。

为清洁和再生局域表面等离子体共振（LSPR）芯片，在300毫升含5%氢气和95%氩气的混合气体中，以40瓦功率进行等离子体灰化处理45秒。灰化后立即通过将芯片浸入由SPO与SPC按3:1比例组成的双组分乙醇硫醇溶液中，对金表面及纳米结构进行功能化修饰。将芯片在硫醇溶液中静置过夜以形成自组装单分子层，随后用乙醇冲洗，并用氮气吹干。

将LSPR芯片放置在定制的微流控夹具的铝制底座上，然后用四个螺丝将芯片夹在底座、硅胶垫圈和透明塑料顶片之间，以固定整个装置。

对于典型的基于SPC的巯基应用，将300微升由133毫摩尔EDC和33毫摩尔NHS在去离子蒸馏水中按1比1混合的溶液滴涂于表面，以活化SPC巯基组分的羧基。静置10分钟后，用10毫摩尔PBS手动冲洗表面。

随后，通过滴加300微升配体溶液，将活化的羧基与目标配体进行偶联。孵育1小时后，用10毫摩尔磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗表面，再在芯片上滴加300微升含0.1摩尔乙醇胺的PBS溶液，以最大限度减少非特异性结合。10分钟后，用含0.005% Tween 20的PBS（即PBS-T20）洗涤乙醇胺。

接下来，在芯片上方放置一块石英片，以减少因弯月面变化引起的数据波动。将芯片安装到显微镜上时，需保持其表面湿润，使用 PBS-T20 缓冲液持续润洗。将微流控管路连接至装置，并通入缓冲液直至达到稳态。然后，将 LSPR 探针组件牢固地放入加热载台的样品槽中。

该方法的光学装置如图所示。来自卤素灯的光经过一个593纳米长通滤光片，以去除对纳米等离激元响应无贡献的波长成分。随后，光被线性偏振，照射样品。 通过 使用数值孔径为1.4的40倍物镜激发等离激元金纳米结构。散射光由物镜收集后，通过交叉偏振器以减少玻璃基底产生的背景信号。在收集的光路中插入50/50分束器，以实现光谱和成像的同步分析。

在让组装好的装置和显微镜平衡至少两小时后，使用操纵杆调整芯片位置，使中央阵列与用于光谱学的光纤对齐。在培养杂交瘤细胞并通过离心收集细胞沉淀后，将其收获。随后，在将细胞接种到局域表面等离子体共振（LSPR）芯片之前，检测细胞活力。接着，使用微量移液器手动将50微升细胞溶液加入LSPR芯片上。最后，利用微流控灌注系统，以新鲜的无血清培养基冲洗掉溶液中残留的细胞，以准备进行LSPR芯片成像。