定量哺乳动物细胞中的大量自噬隔离活性

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大量自噬涉及将自噬货物和可溶性胞质蛋白(包括乳酸脱氢酶或 LDH)隔离在自噬体内进行降解。

为了评估反映大量自噬活性的LDH隔离,请使用电穿孔比色皿,其中含有用抑制剂处理的营养匮乏细胞,以阻止自噬-溶酶体降解。

进行电穿孔以选择性地破坏细胞膜并释放可溶性蛋白质。

细胞破坏物与缓冲蔗糖溶液混合以保留细胞成分。

将所需的稀释破碎物溶液转移到含有缓冲液的管中。离心机将非隔离的LDH与自噬体隔离的LDH分离。

剩余的稀释破坏物溶液(含有总细胞LDH组分)转移到另一个试管中。

两个试管中加入含非离子表面活性剂的缓冲液,以提取螯合的和总的LDH组分。

心并将含LDH的上清液转移到含有丙酮酸和NADH的含缓冲液管中。

LDH 通过 NADH 氧化将丙酮酸转化为乳酸,从而降低与 LDH 浓度相关的 NADH 水平。

定量沉降和总细胞组分中的 LDH 以确定 LDH 螯合。

使用移液器重悬细胞沉淀以获得近乎单细胞的悬液。将该悬浮液转移到 4 毫米电穿孔比色皿中。将比色皿放入指数衰减波电穿孔器中,以 800 伏、25 微法拉和 400 欧姆放电单个电脉冲。

使用新的移液器吸头将破坏细胞转移到含有 400 微升冰冷磷酸盐缓冲蔗糖溶液的 1.5 毫米微量离心管中,并通过移液短暂混合。对每个样品重复此重悬、电极破坏和混合过程。如果是第一次执行该程序,请确保验证有效且选择性的质膜电极破坏,如文中所述。

为了获得沉淀的LDH馏分,从每个稀释的细胞破坏溶液中取出550微升,并将其转移到其自己的2毫升微量离心管中,该管含有900微升冰冷重悬缓冲液,含有0.5%BSA和0.01%吐温-20。短暂移液以混合。在18,000倍g和4摄氏度下离心45分钟,以产生含有沉淀LDH的沉淀。使用抽吸力,彻底吸出上清液,使沉淀尽可能干燥。

将沉

淀的LDH样品储存在-80摄氏度,直到准备好进行分析。对于总 LDH 馏分,将 150 微升从每个稀释的细胞破坏溶液转移到其自己的新管中。将它们存放在零下 80 摄氏度的冰箱中,直到准备好分析。

冰上解冻沉淀的LDH和总LDH样品。解冻后,向总 LDH 样品中加入 300 微升含有 1.5% Triton X-405 的冰冷重悬缓冲液。在冷藏室中用滚筒旋转样品 30 分钟。接下来,向沉淀的LDH样品中加入含有1%Triton X-405的750微升冰冷重悬缓冲液。使用移液器重悬沉淀,直到溶液均匀。将所有样品在 4 摄氏度下以 18,000 倍 g 离心 5 分钟,以沉淀未溶解的细胞碎片。

离心完成后,将样品放在冰上。使用文中描述的经典酶法或任何各种市售试剂盒中的任何一种来确定上清液中的LDH水平。

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Last updated: 18 July 2026