量化哺乳动物细胞中的大分子自噬捕获活性

巨自噬涉及将自噬 cargo 以及可溶性胞质蛋白（包括乳酸脱氢酶或 LDH）包裹进自噬体中进行降解。

为了评估反映整体自噬活性的乳酸脱氢酶（LDH）封存情况，取一个含有经抑制剂处理的营养饥饿细胞的电穿孔比色皿，以阻断自噬-溶酶体降解过程。

进行电穿孔以选择性破坏细胞膜并释放可溶性蛋白质。

将细胞裂解液与缓冲蔗糖溶液混合，以保护细胞组分。

将所需的稀释裂解液转移至含有缓冲液的离心管中。通过离心分离未被隔离的乳酸脱氢酶（LDH）与自噬体隔离的乳酸脱氢酶（LDH）。

将含有总细胞LDH组分的剩余稀释裂解液转移至另一支试管中。

向两个试管中加入含有非离子型表面活性剂的缓冲液，以提取被隔离的和总的乳酸脱氢酶（LDH）组分。

离心并将含有乳酸脱氢酶（LDH）的上清液转移至含有丙酮酸和NADH的缓冲液管中。

LDH 利用 NADH 将丙酮酸盐转化为乳酸，同时氧化 NADH，导致 NADH 水平下降，其下降程度与 LDH 浓度相关。

定量检测沉淀细胞组分和总细胞组分中的乳酸脱氢酶（LDH），以确定LDH的隔离情况。

使用移液器重悬细胞沉淀，以获得接近单细胞的悬浮液。将此悬浮液转移至4毫米电穿孔比色皿中。将比色皿放入指数衰减波电穿孔仪中，并施加一次800伏、25微法、400欧姆的单电脉冲。

使用新的移液枪头将细胞转移至含有 400 微升预冷的磷酸盐缓冲蔗糖溶液的 1.5 毫升微量离心管中，通过移液操作短暂混匀。对每个样品重复此重悬、电极破碎及混匀过程。若首次进行该操作，请务必按照文中所述验证细胞质膜电极破碎的效率与特异性。

为获得沉淀的LDH组分，从每份稀释的细胞裂解液中取出550微升，转移至各自含有900微升预冷重悬缓冲液（含0.5% BSA和0.01% Tween-20）的2毫升微量离心管中。轻轻吹打混匀。在4摄氏度下以18,000 × g 离心45分钟，使LDH沉淀形成蛋白团。使用抽吸法彻底去除上清液，尽量使沉淀保持干燥。

将沉淀的LDH样品在-80摄氏度下保存，直至准备进行分析。对于总LDH组分，从每份稀释的细胞裂解液中转移150 µL至各自新的离心管中。将这些样品置于-80摄氏度冰箱中保存，直至准备进行分析。

将沉淀的LDH和总LDH样品均在冰上解冻。解冻后，向总LDH样品中加入300微升含1.5% Triton X-405的预冷重悬缓冲液。将样品置于冷室中，在旋转仪上旋转30分钟。接着，向沉淀的LDH样品中加入750微升含1% Triton X-405的预冷重悬缓冲液。使用移液器重悬沉淀，直至溶液均匀。将所有样品在4°C条件下以18,000 × g 离心5分钟，以沉淀未溶解的细胞碎片。

离心结束后，将样品置于冰上。使用文中所述的经典酶法测定，或采用任何一种市面上常见的商用试剂盒，测定上清液中乳酸脱氢酶（LDH）的水平。