一种用于评估药物对a疗效的检测方法 结核分枝杆菌 感染模型

取一个含有已建立的 Mycobacterium tuberculosis 或 Mtb 感染模型的多孔板。

孔中含有细胞聚集体，其核心为密集排列的Mtb和感染Mtb后发生坏死的巨噬细胞，外围为未感染的巨噬细胞，模拟了in vivo感染状态。

对利福平和莫西沙星进行系列稀释。

弃去感染板中的培养基，将抗生素稀释液加入各孔，孵育。

抗生素通过细胞聚集体扩散并进入细菌细胞。

利福平结合细菌RNA聚合酶，抑制RNA合成，导致细菌死亡。

莫西沙星结合细菌DNA拓扑异构酶，抑制DNA复制并阻断细菌生长。这种结合还会诱导应激反应，包括活性氧物质的积累，从而杀死细菌。

孵育后，加入刃天青——一种氧化还原指示剂。在存活且具有代谢活性的细菌内部，氧化还原酶将蓝色的刃天青还原为粉红色且具荧光的试卤灵。

通过检测荧光来测定可存活的细菌。

随着抗生素浓度的增加，细菌存活率下降，显示出其对Mtb的有效性。

进行药物测试时，在新的96孔板中将两种抗结核药物各设三个复孔，操作如下：首先，在B2至G10孔中每孔加入125微升7H9-C培养基。接着，在1毫升7H9-C培养基中配制两种药物，使其浓度为所需最高终浓度的两倍。

使用移液器，将每种药物各 250 微升加入孔 B、C 和 D-11，随后分别加入孔 E、F 和 G-11，以进行三复孔处理。接着，使用多通道移液器，通过将 125 微升液体从 B11 至 G11 逐孔转移至 B10 至 G10，对测试药物进行两倍系列稀释。每步操作后，通过移液吹打混合 5 次。

继续将125微升液体从一列移至下一列，从右到左依次移液，至第4列后停止。混合第4列后，将125微升弃入废液容器中。第2列和第3列不应含有任何药物，以便将其用作背景对照和阳性生长对照。

接下来，从培养箱中取出含有结核分枝杆菌感染的巨噬细胞的96孔板。在不倾斜平板的情况下，使用多通道移液器从B2至G11孔中移除150微升培养基。然后，按图示方式倾斜平板，将移液器吸头插入孔的底部边缘，吸出剩余的约50微升培养基。

由于结核分枝杆菌巨噬细胞聚集体会贴附在孔板底部，因此不应有任何物质损失。然而，在去除培养基时应尽可能轻柔，并需小心避免在此过程中重新悬浮聚集体。

轻柔地向含有结核分枝杆菌-巨噬细胞聚集体的培养板 B2 至 G11 孔中各加入 100 µL 7H9-C 培养基。使用多通道移液器，将含药物的 96 孔板中的 100 µL 液体转移至感染板的对应孔中。随后，将培养板放入密封袋中，并在 37 °C 下孵育三天。

刃天青检测法依赖代谢活跃的结核分枝杆菌（Mtb）产生的氧化物质，将蓝色的刃天青转化为荧光粉红色的羟基刃天青。颜色和荧光的变化可作为替代标志物，用于确定细菌的生长量。

将刃天青配制成终浓度为 0.8 毫克/毫升的水溶液，作为储备液。使用孔径为 0.22 微米的 PVDF 膜过滤除菌。将