一种用于筛选抑制Toll样受体信号通路的生物活性纳米颗粒的检测方法

取一块多孔板，其中含有不同的报告巨噬细胞，这些细胞携带在可诱导启动子调控下的分泌型胚胎碱性磷酸酶（SEAP）基因或分泌型荧光素酶基因。

将含有不同肽-金纳米颗粒杂合物与脂多糖（LPS）混合的培养基加入指定的孔中。

LPS 与巨噬细胞的 TLR（Toll 样受体）结合，触发其内化进入内体。

内体中的质子泵将质子转运至内部。酸化作用可触发Toll样受体（TLR）信号通路，从而激活转录因子。

这些因子诱导报告基因的表达，产生SEAP或荧光素酶。

或者，LPS 与杂合体共同内化后，带负电荷的肽基团会螯合管腔内的质子，阻止内体酸化，从而抑制 TLR 信号传导。

收集培养基，离心以分离上清液，然后加入SEAP和荧光素酶的底物。

SEAP 将其底物转化为有色产物，而荧光素酶则催化其底物产生发光。

报告基因信号的降低表明杂合分子在抑制 TLR 信号传导方面的有效性。

将20倍体积的多肽-GNP杂交溶液加入1.5毫升离心管中，在18,000 × g 条件下离心30分钟。小心弃去上清液。将沉淀物转移至一个全新的离心管中，用1毫升PBS洗涤两次。随后，将洗涤后的杂交颗粒重悬于一体积的R10培养基中。取等体积浓缩的杂交颗粒与含LPS的R10培养基混合，使杂交颗粒的终浓度为100 nmol/L，LPS的终浓度为10 ng/mL。

接下来，从巨噬细胞培养板中移除培养基。为每种条件设置三个重复，向每个孔中加入100微升杂交LPS混合物。设置阴性对照和LPS对照。在37°C下孵育24小时后，将每个孔中的培养基转移至独立的离心管中。在4°C下以18,000 × g 离心30分钟。将上清液转移至新的96孔圆底板中。

开始对这些样品进行报告基因检测时，向一个新的96孔平底板的每孔中加入180微升预热的QUANTI-Blue溶液，然后将各样品的20微升上清液转移至该板中。在37摄氏度孵育一至两小时，直至深蓝色显色，光密度超过1。随后，使用酶标仪在655纳米处记录吸光度。接下来，将各样品的10微升新鲜上清液转移至一个96孔透明平底白色板中。

使用自动加样器，向每个孔中加入 50 微升荧光素酶溶液，并立即逐孔记录发光信号。然后，根据文本方案中所述，验证候选化合物的抑制效应并评估 TLR 特异性。