0 次观看 • 6:23 分钟 • July 8th, 2025
取一个含有哺乳动物细胞单层的多孔板。
将来自感染小鼠不同器官的含有寨卡病毒的组织匀浆进行连续稀释后，接种到孔板中。
进入细胞后 通过 内吞作用后，病毒在细胞内增殖并出芽感染邻近细胞。
使用高黏度甲基纤维素溶液覆盖，形成限制病毒移动的物理屏障。
该屏障仅允许感染邻近的细胞，从而形成感染细胞病灶，并确保每个病灶均起源于单个病毒颗粒，实现精确的定量分析。
固定细胞并通透细胞膜。加入能够进入细胞并与病毒抗原结合的一抗。
加入与一抗结合的辣根过氧化物酶标记的二抗。
加入一种显色底物，该底物被过氧化物酶转化生成有色斑点，以指示感染细胞的焦点区域。
通过计数病灶来定量小鼠不同器官中的病毒滴度。
将匀浆样品从负80摄氏度冰箱中取出，置于冰上解冻。待样品解冻后，在稀释板的第一个孔中将寨卡病毒用培养基10倍稀释，然后使用多通道移液器进行10倍系列稀释，每步更换枪头，将20微升样品加入到180微升培养基中。
每次稀释后需更换移液器吸头。准备用于聚焦形成的培养板时，从已铺有Vero细胞的平底96孔板中移除培养基。为防止单层细胞干燥，立即向Vero板的每个孔中加入100 µL病毒稀释液。使用同一套吸头，按照从最低浓度到最高浓度的顺序依次加样。
将培养板左右轻摇2至4次，置于37°C、5%二氧化碳环境中孵育1至2小时。将2%甲基纤维素溶液升温至室温。然后，按大约2:1的比例，用生长培养基稀释2%甲基纤维素溶液。孵育结束后，向96孔板的每孔中加入125 µL甲基纤维素生长培养基。再次于37°C、5%二氧化碳条件下孵育32至40小时。
在生物安全柜中，向96孔板每个孔的甲基纤维素层上方加入50微升5%多聚甲醛，以固定Vero细胞。室温孵育60分钟。或者，用封口膜覆盖培养板，于4摄氏度过夜放置。
随后，使用移液器在生物安全柜内将覆盖层和培养基移除至一次性容器中。每孔加入 150 µL PBS 轻柔洗涤。从培养板中移除 PBS，并将培养板从生物安全柜中取出。重复 PBS 洗涤两次。然后，每孔加入 150 µL FFA 洗涤缓冲液，室温孵育 5 至 10 分钟，以对固定后的细胞进行通透处理。
接下来，使用初级寨卡病毒抗体检测感染。将初级抗体 4G2 用 FFA 染色缓冲液配制为每毫升含 1 微克的浓度。从孔板中甩去 FFA 洗涤缓冲液，每孔加入 50 微升溶于 FFA 染色缓冲液中的初级抗体。然后用封口膜或塑料薄膜密封孔板，并在 4 摄氏度下孵育过夜。
用FFA染色缓冲液将二抗山羊抗小鼠HRP标记抗体稀释至1:5,000浓度。移除抗体溶液后，每孔加入150微升FFA洗涤缓冲液，洗涤细胞三次。每次洗涤后通过轻弹至水槽中去除洗涤缓冲液。
用二抗在FFA染色缓冲液中染色细胞，每孔50 µL，室温孵育1至2小时。随后，用FFA洗涤缓冲液洗涤细胞3次，每次通过轻弹至水槽中去除洗涤缓冲液。
向每个孔中加入 50 µL Trueblue 底物。等待 2 至 15 分钟，直至斑点清晰显现且背景最低。斑点显现后，用手遮挡单层细胞以保护其免受水流冲击，然后用清水轻轻洗涤。用纸巾轻拍干燥。
随后，使用解剖显微镜手动计数每个孔中的斑点，或使用自动斑点计数仪进行计数。在免疫捕获软件中，为每个样本选择一个稀释度，该稀释度下每孔可清晰分辨的焦点数为 20 至 200 个，并利用复孔的平均值计算每毫升中的焦点形成单位滴度（focus-forming units per milliliter）。