剪切应力对经机械感应受体抗体处理的血小板的影响

从含有富血小板血浆的多孔板开始。血小板表达表面机械感受器复合物——可响应机械刺激。

机械感受器复合物包含细胞外配体结合域和与机械感应域相连的巨糖肽区域。

引入抗机械感受器抗体，使其与对侧血小板上受体的配体结合域发生交联。

将经抗体处理的血浆悬液滴加一滴至粘度计的组件之间。

施加剪切应力以模拟机械力，将抗体结合的受体从血小板上拉离，导致大糖肽区域与机械感应结构域解离。

这会引发机械感应结构域的构象改变，从而激活血小板并导致表面标志物的表达。

将剪切后的血小板悬液转移至多孔板中的新孔内。

加入含有荧光标记的特异性分子混合物，使其与血小板表面相应标志物结合，随后用固定液固定细胞。

在流式细胞术中，不同的荧光信号与剪切应力对经抗体处理的血小板所产生的效应相关。

进行配体处理时，将目标抗体或配体缓慢加入富血小板血浆中，并轻轻混匀血小板。孵育期间，打开锥板黏度计，将板温设置为22摄氏度。5至10分钟后，将处理后的富血小板血浆直接转移至温度可控的锥板黏度计的板中央，注意确保所有样品均沉积在锥与板接触点之间的区域。

为了对样品施加剪切力，根据粘度计操作手册计算剪切值，并以适当的速率和持续时间对样品施加剪切。施加剪切结束后，将锥形探头从平板上抬高约2毫米，使样品仍与平板和锥形探头保持接触，然后使用加样枪头从样品体积的中心吸取5至10微升样品。随后，将经过剪切处理的样品与针对目标表面标志物的抗体在室温下孵育20分钟，并在室温下用2%多聚甲醛固定样品20分钟。

通过流式细胞术分析样本时，每种条件至少收集 20,000 个事件，并使用每种荧光染料强度的高度值来量化各荧光标记的信号强度。然后，利用含牛血清白蛋白或溶剂的阴性对照设置门控，排除阴性背景荧光事件，并量化所有实验条件下门内事件所占的百分比。