0 次观看 • 3:29 分钟 • July 8th, 2025
取两个微孔板，其中含有骨髓来源的巨噬细胞或BMMs的盖玻片。
将Leishmania前鞭毛体（细长的具鞭毛阶段）加入一个培养皿中，将无鞭毛体（椭圆形的无鞭毛阶段）加入另一个培养皿中。
孵育期间，寄生虫会结合巨噬细胞受体，从而触发受体介导的吞噬作用。
吞噬体与来自内质网和高尔基体的溶酶体及囊泡融合，成熟为寄生性空泡。
液泡pH值的降低会触发前鞭毛体向无鞭毛体的分化及其复制。
洗涤以去除未内化的寄生虫。
固定感染的巨噬细胞，并加入去垢剂以透化细胞和寄生虫。
加入荧光核酸染料以染色巨噬细胞和寄生虫的细胞核。
将盖玻片固定在载玻片上，在荧光显微镜下观察，定量分析较大的宿主细胞核及其周围较小的无鞭毛体细胞核。
比较无鞭毛前体虫感染的巨噬细胞与复制型无鞭毛体感染的巨噬细胞中无鞭毛体的数量，以评估其在细胞内的增殖情况。
为了用亚马逊利什曼原虫（L. amazonensis）感染细胞，将寄生虫悬液稀释至适当的实验感染复数，并向包括实验所有时间点在内的每块6孔板的每个孔中加入50至100微升寄生虫悬液。将骨髓来源的巨噬细胞在适当的感染时间和温度条件下进行孵育。随后，用每孔2毫升新鲜的37摄氏度、不含钙和镁的PBS洗涤孔板三次，并用1.5至2毫升的2%多聚甲醛固定初始时间点的样本10分钟。
对于对应较晚时间点的培养板，向每个孔中加入 2 毫升新鲜的骨髓来源巨噬细胞培养基，并将培养板放回相应的培养箱中。随后，按照上述方法对每个剩余时间点的细胞进行固定和洗涤，并将样品置于新鲜的 PBS 中，于 4 摄氏度保存。
为了用 DAPI 染色细胞，将上清液替换为 1.5 毫升不含钙和镁的新鲜 PBS，加入 0.1% 非离子型去垢剂，在室温下孵育 10 分钟，随后用不含钙或镁的 PBS 洗涤三次，每次 2 毫升。接着，将细胞在 1 毫升 PBS 中加入 2 微克/毫升的 DAPI 进行染色，在室温下孵育 1 小时。
经过三次洗涤后，将盖玻片细胞面朝下放置在载玻片上，每张载玻片预先滴加商品化的抗荧光淬灭封片剂。随后，为了定量感染细胞的数量，使用荧光显微镜的100倍油镜结合Emanuel计数器，识别围绕每个经DAPI染色的大型巨噬细胞细胞核周围聚集的小型无鞭毛体细胞核数量。