一种用于定量抗菌蛋白酶活性的染料释放检测法

从含有热灭活细菌悬液的试管开始，加入染料溶液进行处理。

染料分子共价结合到肽聚糖——细菌细胞壁的一种必需组分，使其呈现蓝色。

离心收集细菌沉淀，并移除含有未结合染料分子的上清液。

重悬细菌，并向试管中加入抗菌蛋白溶液，触发细菌肽聚糖的酶促水解，导致细胞壁降解，随后发生细胞裂解。

这会导致染料分子的释放，从而产生蓝色着色。

加入乙醇——一种蛋白质变性剂，可使抗菌蛋白失活并终止酶促反应。

离心内容物以沉淀细胞碎片和酶。将含有染料分子的上清液转移至多孔板中。

使用酶标仪，在 595 纳米处测定吸光度。

通过比较经酶处理的样品与未经酶处理的样品的吸光度，以定量分析抗菌蛋白的酶活性。

在染料释放实验中，底物共价连接至雷马素亮蓝R染料（Remazol Brilliant Blue R dye）或RBB。开始本实验方案前，先配制200毫摩尔的RBB溶液。将1.25克RBB溶解于新配制的氢氧化钠溶液中。

接下来，将热灭活的细菌细胞重悬于30毫升RBB溶液中，浓度为0.5克湿重。对于纯化的肽聚糖，将肽聚糖重悬于30毫升RBB溶液中，浓度为0.3克湿重。

由于后续步骤与所用底物无关，以下仅以细菌细胞为例进行标记说明。将反应混合物置于37摄氏度的旋转平台上，温和振荡孵育6小时。6小时后，将反应混合物转移至4摄氏度的培养箱中，继续温和振荡孵育12小时。

孵育完成后，以3,000 × g 离心30分钟，收集染色后的底物。倾去底物沉淀中的染料溶液。用1型水充分重悬沉淀，随后进行离心。以该方法洗涤染料标记的细胞三至五次，以去除底物中非共价结合的可溶性染料。

进行最终洗涤时，将用于染料释放实验的沉淀部分转移至1.5毫升微量离心管中。最后一次洗涤的上清液应澄清，而底物仍保持蓝色。将染色后的底物悬浮于少量水中，于-20摄氏度保存，直至使用。

为进行染料释放实验，先将冷冻的染色底物恢复至室温，并用针对该酶经实验确定的实验缓冲液洗涤两次。本实验中使用磷酸盐缓冲液（PBS）。通过将200微升的反应体积乘以拟进行的染料释放实验次数，计算所需底物悬液的体积。

为制备底物悬浮液，首先将染色底物加入适量体积的磷酸盐缓冲液（PBS）中。进行1:1稀释后，以PBS为空白对照，测定595纳米处的初始光密度值。随后逐步向悬浮液中添加染色底物，直至595纳米处的光密度达到2.0。

在本实验中，将采用染料释放法测定一种蛋白质抗菌剂的最佳孵育条件。首先，按照方案文本中的描述，使用 PBS 将蛋白质抗菌剂原液的浓度调节至 1 毫克/毫升。然后，将该原液稀释至浓度为 100 纳克/微升。

该浓度可使加入检测反应中的每体积样品含有1微克的蛋白质。在0.5毫升的微量离心管中进行反应检测，以评估所需的温度范围。针对每种热处理条件，将10微升的储备蛋白溶液加入200微升已制备的底物悬浮液中。

在热循环仪中孵育八小时，每小时翻转混匀一次。孵育结束后，向每根微量离心管中加入25微升乙醇以终止反应。为去除未消化的不溶性底物，以3,000 × g离心 g 两分钟。随后，小心操作以免扰动未消化的底物沉淀，将每种反应混合物中的150微升反应上清液转移至96孔平底微孔板中。

为了定量测定酶活性，使用微孔板分光光度计在595纳米处测量上清液的吸光度。上清液中由标记底物释放出的可溶性染料导致吸光度升高，该变化可作为酶活性的定量检测指标。