Name: 免疫组化:石蜡切片从Vector实验室使用Vectastain ABC试剂盒 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 38 s
Description: 学习使用Vector Laboratories Vectastain ABC试剂盒对石蜡切片进行免疫组化染色。本方案涵盖脱蜡、水化、热诱导抗原修复、阻断内源性过氧化物酶及抗体孵育等关键步骤，为神经科学和组织学研究提供可靠的染色方法。

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5 minutes

石蜡切片染色
<ol>
<li>用二甲苯（Fisher X3S-4）脱蜡，每次5分钟，共3次（根据使用频率每月更换一次二甲苯，二甲苯具有毒性）。使用Fisher货号08-812-1A的培养皿及配套盖子，以及适配该培养皿的支架，每个培养皿加入200 ml液体。</li>
<li>按以下梯度酒精水化（每两周更换一次梯度试剂）：
<ul>
<li>100% 乙醇（Fisher # A406-20）中浸泡2次，每次2分钟</li>
<li>95% 乙醇中浸泡2次，每次2分钟</li>
<li>70% 乙醇中浸泡1次，2分钟</li>
<li>50% 乙醇中浸泡1次，2分钟</li>
<li>30% 乙醇中浸泡1次，2分钟</li>
<li>ddH2O 中浸泡1次，2分钟</li>
</ul>
</li>
<li>在DPBS中浸泡5分钟（DPBS = 含Ca2+和Mg2+的杜氏改良磷酸盐缓冲液）。</li>
</ol>
抗原修复：
<ol>
<li>将柠檬酸钠缓冲液（10 mM，pH 6.5）在微波炉中预热。 </li>
<li>将载玻片在微波炉中加热15分钟。加热过程中载玻片切勿干燥，需每分钟检查一次，必要时补充柠檬酸钠（Na-Citrate）。</li>
<li>室温下冷却。</li>
<li>用1% H₂O₂封闭内源性过氧化物酶活性2O2 在DPBS中孵育20分钟（50 ml DPBS中加入1.5 ml 30%储备液，Sigma H-1009）。</li>
<li>在DPBS中浸泡，每次5分钟，共3次。</li>
<li>在DPBS中加入5%牛血清白蛋白（BSA）、0.1%叠氮化钠和5%血清，于4°C孵育过夜以封闭非特异性位点。 注意：封闭用血清的选择取决于用于染色的抗体所来源的物种。应使用与二抗（偶联生物素）相同物种来源的血清进行封闭。若该血清不可获得，可选用与一抗来源物种不同的其他物种血清。 </li>
<li>使用亲和素/生物素封闭试剂盒（Vector Laboratories 目录号 # SP-2001）封闭生物素位点： 
<ul>
<li>用Avidin D孵育15分钟。用DPBS短暂漂洗。</li>
<li>在生物素溶液中孵育15分钟。</li>
</ul>
</li>
<li>在室温下，用一抗溶液（DPBS + 2% BSA + 0.1% NaAzide + 2% 血清，与封闭步骤所用血清相同）孵育 2 小时。</li>
<li>在 PBS 中浸泡，每次 5 分钟，共 3 次。</li>
<li>在 DPBS + 2% BSA + 0.1% Na Azide + 2% 血清（与封闭步骤所用相同）中，室温下与生物素标记的二抗孵育 1 小时。</li>
<li>同时配制ABC试剂，因其必须在使用前孵育至少30分钟！！！（见材料）</li>
<li>在50 ml锥形管中配制。加入15 ml不含血清和叠氮化钠的DPBS，再加入3滴试剂A，混匀，随后加入3滴试剂B并混匀。避免挤压试剂瓶，应等待液滴自然形成。ABC试剂盒为Vector Labs生产的Vectastain PK-6100。</li>
<li>在DPBS中浸泡，每次5分钟，共3次。</li>
<li>室温下用ABC试剂孵育30-45分钟。</li>
<li>在DPBS中浸泡，每次5分钟，共3次。</li>
<li>按说明书配制 DAB 过氧化物酶底物（Vector Labs # SK-4100）于 5 ml ddH₂O 中2O 在玻璃小瓶中 使用前立即 （参见材料） 
<ul>
<li>2滴缓冲液原液，混匀</li>
<li>4滴DAB，混匀（应变为微褐色）</li>
<li>2滴H2O2，混合</li>
</ul>
</li>
<li>在载玻片上滴加DAB底物，并观察棕褐色染色。</li>
<li>将载玻片浸入冰水混合物中以终止反应。</li>
<li>用冷水冲洗5分钟。</li>
<li>用苏木精（20秒；Fisher CS401-D）复染，然后用自来水冲洗至流水变清澈。</li>
<li>通过酒精梯度脱水，从30%乙醇开始至100%乙醇（每个浓度2分钟）。</li>
<li>二甲苯浸泡，每次5分钟，共3次。 </li>
<li>用Permount（Fisher # SP15-100）封片：在载玻片的切片上滴加少量封片剂，然后缓慢盖上盖玻片，确保无气泡产生。在完全干燥前，不得移动盖玻片，这需要&nbsp;耗时约 24 小时。 </li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>二甲苯</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td>根据使用频率每月更换一次二甲苯。二甲苯具有毒性。</td></tr><tr><td>100% 乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A406-20</td><td>用于配制乙醇梯度溶液。</td></tr><tr><td>DPBS</td><td></td><td></td><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良磷酸盐缓冲液（含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺）</td></tr><tr><td>柠檬酸钠缓冲液</td><td></td><td></td><td>10 mM，pH 6.5</td></tr><tr><td>H₂O₂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-1009</td><td>30% 原液 =&amp;gt; 用 DPBS 稀释至 1%</td></tr><tr><td>封闭液</td><td></td><td></td><td>DPBS + 5% 牛血清白蛋白 (BSA) + 0.1% 叠氮化钠 + 5% 血清</td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td></td><td></td><td>NaAzide</td></tr><tr><td>亲和素/生物素封闭试剂盒</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP-2001</td><td></td></tr><tr><td>抗体缓冲液</td><td></td><td></td><td>DPBS + 2% BSA + 0.1% 叠氮化钠 + 2% 血清（与封闭步骤所用血清相同）</td></tr><tr><td>ABC 试剂盒 Vectastain PK-6100</td><td>Vector Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAB 过氧化物酶底物</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>ddH₂O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS401-D</td><td>复染剂</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>载玻片和盖玻片</td><td></td><td></td><td>玻璃材质</td></tr></tbody></table>

免疫组织化学：使用vector labs vectastain abc试剂盒的石蜡切片法

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

免疫组织化学（IHC）是一种利用特异性抗体在固定组织切片中定位/可视化蛋白质表达的有价值技术。该技术分为两种方法：直接法和间接法。本实验仅描述间接免疫组织化学染色的使用。间接IHC染色采用高特异性的初级抗体和生物素偶联的次级抗体。初级抗体通过结合特定表位来特异性识别目标蛋白，而次级抗体则有助于消除非特异性背景染色，并通过与初级抗体形成复合物来放大信号。载玻片样本可来源于冰冻切片或包埋于石蜡后固定在玻璃载玻片上的切片。在本方案中，我们讨论了石蜡包埋切片的制备过程，包括脱蜡、梯度酒精水化、热诱导抗原修复，以及内源性过氧化物酶活性和非特异性结合位点的封闭。部分切片随后用针对T细胞标志物CD8的抗体进行染色，而另一些切片则用酪氨酸羟化酶特异性抗体染色。接着，切片孵育相应的生物素偶联次级抗体，再使用与亲和素偶联的辣根过氧化物酶（HRP）及以二氨基联苯胺（DAB）为底物进行显色反应。显色完成后，切片进行对比染色（复染），并用中性树胶封片。在充分干燥后，这些切片即可用于成像。

关键词：免疫组织化学，IHC，间接染色，石蜡包埋切片，CD8，酪氨酸羟化酶，DAB，HRP，生物素，抗原修复

免疫组织化学：使用Vector Labs Vectastain ABC试剂盒的石蜡切片法

免疫组织化学（IHC）是一种有价值的实验技术，通过使用特异性抗体，在固定的组织切片中定位/可视化蛋白质表达。

大家好，我是 Victor Chi，加州大学欧文分校生理学与生物物理学系 Chandy 实验室的一名研究生。今天我将演示如何使用 Vector Laboratories 公司的 A b, C 试剂盒对石蜡包埋切片进行染色。该实验流程包括脱蜡和水化石蜡包埋切片、通过加热诱导抗原修复以暴露抗原、阻断过氧化物酶和非特异性蛋白结合、与 CD4 和酪氨酸羟化酶一抗及二抗孵育，以及显色和封片。那么我们开始吧。由于切片是用石蜡包埋的，第一步是脱蜡。通常在通风橱中进行，使用三罐二甲苯，每次清洗5分钟，共清洗三次。随后将载玻片放入100%乙醇中。您会注意到载玻片上的石蜡已经消失，但请小心不要用手套直接接触载玻片，因为二甲苯会溶解手套的橡胶材质。接着，将载玻片从100%乙醇中转移回实验室，进行梯度水化处理。接下来，我将向您介绍我们的载玻片需要经过的梯度水化过程。该过程首先使用两缸浓度为100%的乙醇。随后，我们将载玻片转移至两缸含有95%乙醇的溶液中。然后将载玻片转移至70%乙醇溶液中浸泡，随后将载玻片转移至50%乙醇溶液中。接着，将载玻片转移至30%乙醇溶液中，两分钟后将其转移至双蒸水中。经双蒸水处理后，将载玻片置于PBS中孵育。现在我将向您展示如何使用载物架将载玻片从一个染色缸转移到下一个染色缸。第一步是使用载物架取出载玻片，并轻轻刮去多余的液体，以避免将过多液体带入下一个染色缸中。随后将其完全浸入溶液中，并等待两分钟，直至进行下一次梯度更换。许多情况下，组织固定后抗原会被遮蔽，导致抗体无法与其结合。因此，我接下来将向您展示一种使用柠檬酸钠进行热诱导抗原修复的方法。现在我们来到微波炉前，我将在此对CD8抗原进行去遮蔽处理，以便后续通过免疫组织化学方法进行检测。接下来，我将把溶液放入微波炉中加热15分钟。因此，我们将载玻片与柠檬酸钠溶液一起煮沸15分钟，以确保载玻片不会干燥。我们会密切观察载玻片，一旦溶液沸腾溢出，立即补充柠檬酸钠溶液，以确保载玻片始终保持湿润状态。因此，在将玻片放入柠檬酸钠溶液之前，我已将溶液预热45秒。随后将玻片放入柠檬酸钠溶液中，并开始加热该溶液15分钟。在此过程中，玻片始终置于溶液内，通常在加热沸腾约两至两分半钟时，溶液开始出现沸腾溢出的现象。此时，我将停止并用新鲜的柠檬酸钠替换已损失的柠檬酸钠。将柠檬酸钠煮沸15分钟后，我们需要取出载玻片和溶液并进行冷却。最佳操作方法是盖上染色缸盖子，倒掉多余的液体，然后将其置于冷水中冲洗，直到瓶内溶液冷却至室温。这通常需要大约10到15分钟。因此，在将载玻片从水槽中取出后，我们需要阻断组织中的内源性过氧化物酶活性。为此，我们将使用30%过氧化氢配制1%的过氧化氢溶液。然后，我将切片直接转移至过氧化氢溶液中。现在，我们将切片在过氧化氢溶液中孵育20分钟。20分钟结束后，在阻断内源性过氧化物酶活性后，我将使用PBS洗涤液清洗切片上的过氧化氢。接下来，我将把载玻片转移到染色架上，并用三次洗涤进行清洗，每次洗涤持续五分钟。这些载玻片已背对背放置，以避免与其他载玻片接触，从而防止组织受损。现在我只是将载玻片滑入染色架中，并合理排列载玻片，确保组织部分不会接触到玻璃表面。接下来将载玻片转移至 PBS 中。在用 PBS 清洗载玻片后，现在我将使用含有 5% BSA、5% 山羊血清和 0.1% 叠氮化钠的溶液对载玻片进行封闭，以阻断蛋白质的非特异性结合。如果你使用的是山羊来源的抗体，则需要将山羊血清更换为其他物种的血清。现在，我将把载玻片放入载玻片架中，并加入我们的溶液。通常情况下，我只加到一半的位置，这样加上载玻片的体积后，刚好可以确保组织完全浸没在溶液中。将载玻片放入容器时，需要注意的一点是，避免组织接触到容器的侧壁。因此，在放置最后一张切片时，应将其向内旋转，以确保组织不接触容器壁。现在，我的切片已经用封闭液在室温下封闭过夜，接下来我将用 PBS 溶液进行三次洗涤，每次五分钟，以洗去多余的封闭液。此时，我们需要在组织周围使用液体阻断剂画一个圈，以尽量减少抗体的使用量。如果你不担心抗体的用量，那么可以始终在进行封闭步骤时使用的同一湿盒中孵育载玻片。接下来，我将向你演示如何用液体阻断剂在组织周围画圈。首先，去除多余的液体和血液，注意不要触碰组织。因此，只需擦拭角落以去除多余的液体。再次注意，务必非常小心，不要触碰到组织。取液体阻断针，轻轻按压以启动液体流动，然后用笔围绕组织画圈。让液体阻断剂干燥约15秒。此时，我们需要加入一抗。使用移液器，确保将一抗完全覆盖组织，并将其转移至湿度控制盒中。因此我们使用一张Kimwipe，将其与一些去离子水一起放入此盒中，以防止载玻片在与一抗孵育过程中干燥。现在我们的一抗已经孵育了一小时，接下来将取出载玻片，并用PBS洗去多余的抗体。再次，让液体自然流干，然后将组织放入 PBS 洗涤液中。同样，洗涤三次，每次五分钟。在完成三次五分钟的洗涤后，我们将以与添加一抗相同的方式向组织中加入二抗。只需使用足以覆盖组织的体积，加入二抗（我们使用的是生物素标记的羊抗兔抗体），然后将切片放回湿度控制孵育盒中。在使用ABC法时，使用这种生物素化的二抗（羊抗兔）至关重要。因此，我们将切片转移至湿度控制孵育盒中，室温孵育1小时。因此，在孵育二抗的同时，我们需要准备ABC试剂。我们使用的是Vector Laboratories的Vector染色试剂盒中的A、B、C试剂。取出试剂A，先预润管尖，然后让其滴入15毫升PBS中三次，注意不要挤压管体，因为液滴必须精确计量且大小固定。在二抗孵育约一小时后，取出切片，像处理一抗一样，再次用 PBS 洗涤。经过三次、每次五分钟的洗涤后，将切片转移至另一个容器中，加入提前 30 至 45 分钟配制好的 A、B、C 试剂。只需将 A、B、C 试剂加入容器中，充分覆盖切片，并继续孵育 30 至 45 分钟。因此，在载玻片于A、B、C溶液中静置约34到5分钟后，我们需要洗去多余的A、B、C溶液。此时只需取出载玻片，放入PBS溶液中。需在PBS中重复相同的洗涤步骤三次，每次洗涤5分钟。在玻片洗涤的同时，我从Vector Laboratories配制DAB过氧化物酶底物。取pH 7.5的缓冲液，加入两滴。加入pH 7.5缓冲液后，再取DAB底物反应试剂，加入两滴。同样，滴加的液滴大小非常关键，因此不要挤压瓶子，只需让液滴自然滴落。缓冲液 pH 7.5 加两滴，DAB 底物试剂则需加入四滴，并同样让其自然滴下。最后还需加入两滴过氧化氢底物试剂。DAB底物试剂混合液应呈现如此外观。现在可将该混合液加入载玻片中，请取出载玻片，让PBS液体自然流尽。随着时间推移，DAB试剂的颜色会逐渐变深呈棕色。因此，我们希望在此时将其加入到切片上。取足够覆盖组织的体积，直接滴加到组织样本上即可。因此，取适量体积的溶液，直接加在组织样本上，静置使其反应，随着时间推移，组织样本应逐渐变为棕色。加入DAB溶液后，可观察到该脑切片中此处和此处的组织变棕。棕色的DAB显色表明该区域含有中脑多巴胺能神经元。将切片孵育 2 到 10 分钟后，需将切片放入冰水中以终止反应。先让溶液自然流尽，然后直接将切片放入冰水中。将切片浸入冰水后，将容器移至水槽，用冷水冲洗约 5 分钟，以确保所有 DAB 溶液均被彻底清除。因此，当你加入终洗液时，需小心操作，避免液流直接冲击组织，应让液体流向容器的一角，使其自然溢满，从而避免水流冲击干扰组织。在将玻片从洗涤液中取出后，你需要进行复染。那么，为什么要进行复染呢？其中一个原因是您可能希望观察组织的结构，另一个原因是可视化所有细胞。因此，为了达到我们的目的，我们将使用苏木精进行复染，以标记细胞核。因此，我们只需取来载玻片，去除多余的液体，然后将其在伊红-伊红素溶液中浸染一次。取出后，立即直接放入水中。将载玻片放入自来水中后，需取出载玻片并在水流下冲洗，操作方式与之前使用冰水浴时相同。因此，对于苏木精复染后的冲洗，只需用流动水冲洗，直到染色缸内的水变清澈为止。将复染后的玻片从水中取出后，我们需要对玻片进行再次脱水，因此需将玻片按照相反顺序重新通过乙醇梯度脱水。因此，依次用去离子水洗涤一次，30%乙醇洗涤一次，50%乙醇洗涤一次，70%乙醇洗涤一次，95%乙醇洗涤两次，每次各两分钟，100%乙醇洗涤两次，每次各两分钟。取出载玻片，擦去多余液体后直接放入30%乙醇中，静置两分钟。在最后一次100%乙醇洗涤后，需将载玻片重新放入二甲苯中。再次取来载玻片，刮去多余的液体，将载玻片放入第一缸二甲苯中，浸泡5分钟。随后需连续进行三次二甲苯洗涤，每次5分钟。现在我们已准备好对载玻片进行封片。通常，我会在玻片即将准备好前一分钟，用移液器吸取封片液，并在玻片完成最后一步二甲苯清洗前约一分钟开始准备。在最后一次二甲苯清洗后，需小心操作，避免手套浸入二甲苯或被其润湿，使用镊子将玻片取出时，注意辨认组织所在的一面。用无尘纸轻轻擦去多余的二甲苯，注意不要触碰组织，仅小心擦拭玻片的角落和边缘，使大部分二甲苯得以挥发。通常情况下，在其中一张玻片干燥之前，你可以同时处理两张玻片。因此，当你擦干一张载玻片时，另一张载玻片应已准备好进行操作。现在必须在它们完全干燥之前尽快操作。取用Perimount，在组织旁边画一条细线，注意不要触碰到组织。取下盖玻片周围的封片剂。以45度角放置盖玻片，使其自然下弯，然后滑动盖玻片，确保封片剂覆盖所有组织。然后将其平放并轻轻按压中心位置，以去除所有多余的气泡。在等待其干燥的同时，可以进行第二张组织切片的处理；但此时不应立即观察玻片。因此，在观察玻片前，我们需要让永久封片剂过夜完全干燥。否则，在显微镜下观察时，永久封片会产生气泡，从而损坏您的样本。以下是使用化学试剂染色后的大脑切片图像，所用试剂为兔多克隆抗体，靶向酪氨酸羟化酶。再次说明，棕色的DAB染色显示了中脑多巴胺能神经元的位置。血色素复染使该组织中所有细胞核呈现蓝色。刚才我已向您演示了如何使用Vector Laboratories的ABC试剂盒对石蜡包埋切片进行染色。接下来，您需要根据所要染色的组织类型以及所使用的抗体来优化染色条件。祝您的实验顺利。

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